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倒置熒光顯微鏡的構(gòu)成|原理|用途
倒置熒光顯微鏡是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡所屬光學(xué)儀器的一種，特點(diǎn)是激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。倒置熒光顯...[查看全部]
熒光顯微鏡是利用特定波長的光，照射被檢物體產(chǎn)生熒光進(jìn)行鏡檢的光學(xué)觀測儀器，已有100多年歷史。熒光顯微鏡是在復(fù)式顯微鏡上安裝熒光裝置集合而成，熒光裝置包括熒光光源、激發(fā)光光路、激發(fā)/發(fā)射濾光片組件等器件。
熒光顯微鏡工作原理熒光顯微鏡是醫(yī)院科研、病理、檢驗(yàn)等部門常用的醫(yī)用光學(xué)儀器之一。因?yàn)槠胀ǖ娘@微鏡是在明亮的背景上觀察暗物，而熒光顯微鏡是在暗背景下觀察彩色的圖像，因此它比普通的顯微鏡分辨力提高100倍，可以觀察到普通顯微鏡看不到的細(xì)節(jié)。但是它的調(diào)整，校正難度較高，只要解決了熒光顯微鏡的問題，其它顯微鏡問題就迎刃而解。
下圖是熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)圖。由汞燈發(fā)出的各種譜線的光線，經(jīng)激發(fā)濾光片后只讓某一種波長的紫外光線通過，如波長為404.7nm藍(lán)紫光，經(jīng)反光鏡后，激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光。激發(fā)濾光片將其他波長的光線濾掉，并使樣品激發(fā)熒光，所以稱其為激發(fā)濾光片。通常，激發(fā)產(chǎn)生的熒光波長比激發(fā)樣品的光的波長大得多，是可見光。這樣產(chǎn)生的熒光和透過樣品的一部分激發(fā)光(紫外光)，經(jīng)物鏡成像后，人眼即可用目鏡觀察熒光圖像。為了防止紫外光進(jìn)入目鏡視場，降低圖像襯度和損傷人眼，放置了一塊截止濾光片，它只讓某一部分波長的譜線通過，如只讓500～750nm的可見光通過，而不讓500nm以下的光通過。
從圖中可以看出，光源是熒光顯微鏡主要組成部分，熒光顯微鏡都采用200W的超高壓汞燈作光源。它是由石英玻璃制作，中間呈球形，內(nèi)充有一定量的汞，工作時(shí)在兩極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)水銀完全蒸發(fā)時(shí)，可達(dá)50～70個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力，這一過程一般約5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子在不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫光，足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)，因此被熒光顯微鏡普遍采用。
熒光顯微鏡的激發(fā)熒光方式熒光顯微鏡是免疫熒光組織化學(xué)的基本工具。它是由超高壓光源、濾
... 查看全文熒光顯微鏡是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的基本工具，由光源、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。熒光顯微鏡利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標(biāo)本的熒光圖像。
一、光源：
熒光顯微鏡多采用200W的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃制作，中間呈球形，內(nèi)充一定數(shù)量的汞，工作時(shí)由兩個(gè)電極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)水銀完全蒸發(fā)時(shí)，可達(dá)50～70個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光，足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)，因此，為熒光顯微鏡普遍采用。超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜太高。
超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃，使用一些時(shí)間后，則需要高壓啟動(約為15000V)，啟動后，維持工作電壓一般為50～60V，工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命，在每次使用2h的情況下約為200h，開動一次工作時(shí)間愈短，則壽命愈短，如開一次只工作20min，則壽命降低50%。
因此，使用熒光顯微鏡時(shí)盡量減少啟動次數(shù)。燈泡在使用過程中，其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動。點(diǎn)燃燈泡后不可立即關(guān)閉，以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極，一般需要等15min。由于超高壓汞燈壓力很高，紫外線強(qiáng)烈，因此燈泡必須置燈室中方可點(diǎn)燃，以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸時(shí)造成操作者受傷。
二、濾色系統(tǒng)：
濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位，由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板型號，各廠家名稱常不統(tǒng)一。濾板一般都以基本色調(diào)命名，前面字母代表色調(diào)，后面字母代表玻璃，數(shù)字代表型號特點(diǎn)。
1、激發(fā)濾板：根據(jù)光源和熒光色素的特點(diǎn)，提供一定波長范圍的激發(fā)光。
紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過。
... 查看全文熒光顯微鏡是光學(xué)顯微鏡的一種，是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的基本工具。以紫外線為光源，用以照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后觀察物體的形狀及其所在位置。用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。
熒光顯微鏡的發(fā)展自從1590年詹森父子發(fā)明顯微鏡以來，已有400多年的歷史。顯微鏡的發(fā)展一直是以提高圖像的對比度和分辨力為主要目標(biāo)。
熒光顯微鏡是以紫外光或藍(lán)紫單色光激發(fā)標(biāo)本來產(chǎn)生熒光，因?yàn)樽贤夤獠豢梢姡视蓸?biāo)本發(fā)出的熒光與背景反差很大，即熒光顯微鏡通常在黑暗的背景下觀察彩色的圖像;而普通顯微鏡是在明亮的背景下觀察較暗的樣品。這樣熒光顯微鏡的對比度比普通顯微鏡提高約100倍，因此可觀察到普通顯微鏡下看不到的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。熒光顯微鏡具有對比度高這個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)，得到了廣泛的應(yīng)用。
透射式熒光顯微鏡：
下圖(a)是透射式熒光顯微鏡的原理圖。由汞燈發(fā)出的各種譜線的光線，經(jīng)激發(fā)濾光片后只讓某一種波長的紫外光線通過，如波長為404.7nm藍(lán)紫光，經(jīng)反光鏡后，激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光。這個(gè)濾光片將其它波長的光線濾掉，并使樣品激發(fā)熒光，所以稱激發(fā)濾光片。
通常，熒光波長比激發(fā)樣品的光的波長大得多，是可見光。這樣產(chǎn)生的熒光和透過樣品的一部分激發(fā)光(紫外光)，經(jīng)物鏡成像后，人眼即可用目鏡觀察熒光圖像。為了防止紫外光進(jìn)人目鏡視場，降低圖像材度和損傷人眼，安放了一塊截止濾光片，它只讓某一部分波長的譜線通過，如只讓500～750nm的可見光通過，而不讓500nm以下的光通過，所以稱為截止濾光片。
反射式熒光顯微鏡：
上圖(b)是反射式熒光顯微鏡的原理圖。反射式熒光顯微鏡和透射式熒光顯微鏡的原理類同。
反射式熒光顯微鏡有下列優(yōu)點(diǎn)：
①光能的利用率高。在反射式熒光顯微鏡中，激發(fā)光直接照射在標(biāo)本的觀察表面;而在透射式熒光顯微鏡中，激發(fā)光穿過具有一定厚度的標(biāo)本后才抵達(dá)觀察表面，能量被衰減
... 查看全文熒光顯微鏡是以紫外線為光源，用以照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。
熒光顯微鏡的使用方法1、用窗簾遮蔽光線，關(guān)閉房間內(nèi)的電燈，除去熒光顯微鏡的防塵罩，確保熒光顯微鏡燈室通風(fēng)良好、無遮蓋。裝上汞燈燈箱，并轉(zhuǎn)動燈箱卡圈上的撥桿，將燈箱與鏡臂連接。
2、將汞燈燈箱的電源插頭插入熒光電源箱后的插座，再將熒光電源箱的插頭插入220V外接電源。
3、打開熒光顯微鏡電源開關(guān)，電壓表顯示出電源電壓，如電源電壓波動不大于額定電壓值的5%，即可按下啟動開關(guān)點(diǎn)燃汞燈，如因天氣太冷或電壓不穩(wěn)定等原因，一次啟動未點(diǎn)燃汞燈，可以多按幾次。待超高壓汞燈弧光達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)并達(dá)到最大發(fā)光效率，即可開始工作。
4、燈泡的調(diào)中：
①任選一塊標(biāo)本放在熒光顯微鏡載物臺上。
②轉(zhuǎn)動鏡臂上的聚光鏡旋鈕使聚光鏡移出光路，轉(zhuǎn)動濾色片組轉(zhuǎn)換手輪，將紫光(V)或藍(lán)光(B)或綠光(G)激發(fā)濾色片組轉(zhuǎn)入光路，并將25熒光物鏡轉(zhuǎn)入光路。
③調(diào)節(jié)粗微調(diào)手輪，將標(biāo)本像調(diào)焦清晰。
④前后推動垂直照明器右邊的聚光鏡調(diào)焦推桿，使視場光欄成像清晰，轉(zhuǎn)動視場光欄撥桿將視場光欄收小，調(diào)節(jié)視場光欄調(diào)中螺釘使視場光欄居中，然后再將視場光欄開至最大。
⑤轉(zhuǎn)動鏡臂上的聚光鏡旋鈕使聚光鏡移入光路，前后調(diào)節(jié)燈箱上的聚光鏡撥桿，使汞燈的弧光在視場內(nèi)成像清晰。
⑥調(diào)整燈箱上的燈泡水平調(diào)節(jié)螺釘和垂直調(diào)節(jié)螺釘，使汞燈的弧光居中。
⑦調(diào)整反光鏡水平調(diào)節(jié)螺釘和垂直調(diào)節(jié)螺釘，使光源的反射像與汞燈的弧光分開。
⑧轉(zhuǎn)動聚光鏡旋鈕把聚光鏡移出光路，此時(shí)視場照明均勻。
5、熒光觀察：
①將熒光染色標(biāo)本放到熒光顯微鏡載物臺上。
②將10x平場物鏡或25x熒光物鏡轉(zhuǎn)入光路，調(diào)節(jié)載物臺縱橫移動手輪，將標(biāo)本移入光路。
③轉(zhuǎn)動濾光片轉(zhuǎn)換撥輪，將熒光染色標(biāo)本所
... 查看全文熒光顯微鏡是以紫外線為光源，用以照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡是基于熒光成像進(jìn)行光度分析的光學(xué)測量儀器，廣泛用于生命科學(xué)研究和臨床實(shí)驗(yàn)室診斷等領(lǐng)域。
熒光顯微鏡的校準(zhǔn)熒光顯微鏡比普通顯微鏡復(fù)雜，使用也比較麻煩，但只要注意下面幾點(diǎn)，用戶自行作些校準(zhǔn)還是很容易的。
1、汞燈的校準(zhǔn)
基于熒光顯微鏡的原理，決定了選用汞燈作為其光源。由于標(biāo)本產(chǎn)生的熒光比較弱，為了得到較亮的圖像，汞燈的校準(zhǔn)至關(guān)重要。具體校準(zhǔn)步驟如下：
①開啟汞燈后，在熒光顯微鏡工作臺上放一張白紙，并從物鏡轉(zhuǎn)換器中轉(zhuǎn)出物鏡，即轉(zhuǎn)換器上出現(xiàn)的空孔位于光軸上，卸去轉(zhuǎn)換器上保護(hù)蓋(如無空孔，可卸掉一個(gè)低倍物鏡，校準(zhǔn)完畢后再旋上)。轉(zhuǎn)動熒光顯微鏡主體內(nèi)的濾光片座，選一個(gè)透過綠光的濾光片組，使反射照明有光通過物鏡轉(zhuǎn)換器孔，此時(shí)在白紙上可以看到汞燈照亮的光斑。如光斑太亮，可以插入中性濾光片，或帶上太陽眼鏡，以保護(hù)眼睛。
②轉(zhuǎn)動聚光鏡調(diào)焦旋手，使汞燈光弧在白紙上成像清晰。因汞燈室內(nèi)裝有一個(gè)球面反光鏡，用來增加亮度，于是在白紙上看到兩個(gè)光弧的像。旋轉(zhuǎn)汞燈調(diào)節(jié)旋手和反光鏡位置調(diào)節(jié)旋手，使兩個(gè)光弧并立。再轉(zhuǎn)動反光鏡聚焦調(diào)節(jié)旋手，使兩個(gè)光弧有接近相等的亮度。
③旋轉(zhuǎn)汞燈調(diào)節(jié)旋手和反光鏡位置調(diào)節(jié)旋手，使兩個(gè)光弧重合。再調(diào)節(jié)聚光鏡調(diào)焦旋手，得到放大和均勻的光弧像。這樣汞燈校準(zhǔn)工作就完成了。轉(zhuǎn)入物鏡后，根據(jù)物鏡具體倍率，稍微調(diào)節(jié)一下聚光鏡調(diào)焦旋手就可以了。
2、孔徑光闌和視場光闌的校準(zhǔn)
一般熒光顯微鏡均采用柯勒照明。所謂柯勒照明是一種能夠得到圖像最大對比和最大分辨的折中方法。這時(shí)，燈絲成像在孔徑光闌上，一般也成像在物鏡最后一片鏡框上。孔徑光闌是限制光源大小的光闌，而視場光闌是限制人眼在目鏡里看到視野大小的光闌。只有在正確校準(zhǔn)柯勒照明的條件下，熒光顯微鏡才能獲得它的最佳光學(xué)性能。
... 查看全文倒置熒光顯微鏡是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡所屬光學(xué)儀器的一種，特點(diǎn)是激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。
倒置熒光顯微鏡的構(gòu)成倒置熒光顯微鏡由熒光附件與倒置顯微鏡有機(jī)結(jié)合構(gòu)成的，主要用于細(xì)胞等活體組織的熒光、相差觀察。
倒置顯微鏡是為了適應(yīng)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的組織培養(yǎng)、細(xì)胞離體培養(yǎng)、浮游生物、環(huán)境保護(hù)、食品檢驗(yàn)等顯微觀察。由于這些活體被檢物體均放置在培養(yǎng)皿(或培養(yǎng)瓶)中，這樣就要求倒置顯微鏡的物鏡和聚光鏡的工作距離很長，能直接對培養(yǎng)皿中的被檢物體進(jìn)行顯微觀察和研究。因此，物鏡、聚光鏡和光源的位置都顛倒過來，故稱為“倒置顯微鏡”。
倒置顯微鏡多用于無色透明的活體觀察，在倒置顯微鏡的基礎(chǔ)上添加一套熒光附件：激光激發(fā)塊，熒光光源，熒光照明器，激發(fā)塊切換裝置，即可進(jìn)行倒置熒光觀察。
倒置熒光顯微鏡是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡所屬光學(xué)儀器的一種，是激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上一個(gè)雙色束分離器，它與光軸呈45°角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片/雙色束分離器/阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈強(qiáng)。
倒置熒光顯微鏡適用于對活體細(xì)胞和組織、流質(zhì)、沉淀物等進(jìn)行顯微研究，是生物學(xué)，細(xì)胞學(xué)，腫瘤學(xué)，遺傳學(xué)，免疫學(xué)等研究工作的理想儀器。可供科研、高校、醫(yī)療、防疫和農(nóng)牧等部門使用。倒置熒光顯微鏡是由倒置顯微鏡和落射熒光顯微鏡組成。儀器配有長工作距離平場消色差物鏡、大視野目鏡、雙目觀察，倒置顯微鏡還配有特長或超長工作距
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