天美（中國）科學(xué)儀器有限公司

使用himacCP-NX超速離心機(jī)及P40ST水平轉(zhuǎn)頭

      G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）主要位于細(xì)胞膜，并接收多種不同的信息，如光，味道，神經(jīng)遞質(zhì)，及其它外部信號，并且這些信號通過G-蛋白轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)。眾所周知，GPCRs及相關(guān)蛋白與多種疾病密切相關(guān)，并作為被研究目標(biāo)在新藥開發(fā)中起到關(guān)鍵作用。GPCRs也在歷史上兩次諾貝爾獎(jiǎng)（1994年的生理/醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)及2012年的化學(xué)獎(jiǎng)）中吸引了相當(dāng)?shù)年P(guān)注。GPCRs是目前最吸引全球關(guān)注的蛋白之一。

      本文將介紹從脂質(zhì)筏分離G-蛋白的離心方法。由于脂質(zhì)筏可抵抗表面活性劑，我們將脂質(zhì)筏溶在表面活性劑中，并通過使用蔗糖梯度液等密度梯度離心進(jìn)行分離純化G-蛋白。通過脂類的不同密度將該類蛋白與膜的其它部分分開并純化。

詳細(xì)步驟：

1.原始樣品：鼠小腦顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液

2.樣品準(zhǔn)備：將鼠小腦顆粒細(xì)胞混懸于2ml含有1%Triton X-100的TNE緩沖液

中，勻漿該混懸液，再加等量的含80%蔗糖液的2mlTNE緩沖液，混勻。

3.離心設(shè)備：

主機(jī)及轉(zhuǎn)頭及輔助設(shè)備：

himac超速離心機(jī)CP-NX及水平轉(zhuǎn)頭P40ST,并可選擇使用himac的DGF-U密度制備儀進(jìn)行梯度液自動(dòng)制備

           CP100NX                                          P40ST轉(zhuǎn)頭                     DGF-U密度制備儀

◆himac超速離心機(jī)：

√最高轉(zhuǎn)速100000rpm

√最大RCF803000xg

√實(shí)時(shí)運(yùn)行曲線及記錄

√遠(yuǎn)程監(jiān)控和診斷

√驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)十年保用

√轉(zhuǎn)頭壽命自動(dòng)管理

√用戶管理和密碼鎖控制

√符合GMP要求

◆DGF-U密度梯度制備儀：

可在不同的離心管內(nèi)自動(dòng)制作梯度液，而且離心分離后樣品及梯度液可自動(dòng)連續(xù)取出，并可通過連接到帶連續(xù)流動(dòng)池的紫外分光光度計(jì)及餾分器，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)檢測及收集

4.離心條件：

P40ST水平轉(zhuǎn)頭（40000rpm,13mlx 6）

離心管：13PA管

轉(zhuǎn)速：40000rpm（RCF：284000xg）

離心時(shí)間：17小時(shí)

溫度：4℃

加減速速率：8加/8減

樣品量：4ml

密度梯度液：6ml5-30%蔗糖的連續(xù)密度梯度液

5.操作過程：

將4ml樣品加到13PA管底部，然后將6ml含有TNE緩沖液的5-30%蔗糖梯度液加到樣品層上。再將P40ST轉(zhuǎn)頭放置到CP100NX上，在40000rpm（200000xg）下離心17小時(shí)。離心結(jié)束后，按每

1ml從上到下分步收集梯度液，并分別放置在標(biāo)注好的第1-10管內(nèi)。含有G-蛋白的脂筏層DRM

（抗detergent的脂膜）將在第3-5管，而非脂筏層將在第7-10管。詳見下圖示例：

6.所用試劑：

TNE緩沖液（25mMTris-HCL，150mMNaCl，1mMEGTA，pH7.5）

TNE緩沖液+1%Triton X-100

80%蔗糖在TNE緩沖液內(nèi)

30%蔗糖在TNE緩沖液內(nèi)

5%蔗糖在TNE緩沖液內(nèi)

（來源：天美（中國）科學(xué)儀器有限公司）