蛋白質(zhì)純化是蛋白質(zhì)研究中不可缺少的環(huán)節(jié)，只有了解蛋白質(zhì)的分子量、溶解性、等電點(diǎn)以及穩(wěn)定性等基本性質(zhì)，才能達(dá)到有效純化。根據(jù)目標(biāo)蛋白的物理或化學(xué)性質(zhì)的不同，可以有針對(duì)性地采取不同的蛋白質(zhì)純化方法。

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是生物體內(nèi)的功能性大分子。隨著分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、基因組學(xué)等研究的不斷深入，人們意識(shí)到僅靠基因組的序列分析來(lái)闡明生命活動(dòng)的現(xiàn)象和本質(zhì)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，只有從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度來(lái)研究蛋白質(zhì)，才能更好地把握生命現(xiàn)象和規(guī)律，揭示其本質(zhì)。

要研究蛋白質(zhì)，首先要得到高純度的、具有生物學(xué)活性的、相對(duì)穩(wěn)定的目的蛋白質(zhì)，然后才能對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行研究，進(jìn)而才可能大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用，以造福人類。而蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中一般都是以復(fù)雜的混合物的形式存在，不同類型的細(xì)胞中含有不同結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)，這就使得蛋白質(zhì)純化成為一項(xiàng)精細(xì)而復(fù)雜的任務(wù)。因此，高效的蛋白純化技術(shù)和手段是蛋白質(zhì)研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵之一。

蛋白質(zhì)純化的目的通常是為了獲得純品蛋白質(zhì)，以便深入研究蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)、活性機(jī)制、空問(wèn)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，所以蛋白質(zhì)純化的意義在于：

1、研究生命本質(zhì)的需要從生物材料中純化制備蛋白質(zhì)，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對(duì)于了解生命活動(dòng)的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。

2、工業(yè)生產(chǎn)的需要食品、發(fā)酵、紡織、皮革等工業(yè)需要大量高活力的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。

3、醫(yī)療的需要許多蛋白質(zhì)是安全有效的藥品，如蛋白水解酶復(fù)劑作為消化藥物被廣泛使用尿激酶可以治療各種血栓性疾病等。

4、基因工程的需要對(duì)具有生理活性的蛋白質(zhì)和酶進(jìn)行基因工程改造，以提高其生理活性、酶活力和蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性等，必須首先得到純化的蛋白質(zhì)，在純品蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上再進(jìn)行改造，如定點(diǎn)突變等。

1、基于分子大小差異的蛋白質(zhì)純化技術(shù)

①凝膠層析

凝膠層析又稱為凝膠過(guò)濾、分子篩層析或排阻層析，是利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)分子大小差異純化混合物的方法。由于該法上樣量有限，常用在純化的最后一步，并與其他純化方法(如離子交換)組合使用。純化過(guò)程中，在保證原有生物活性的基礎(chǔ)上考慮裝柱、流速、洗脫液的選擇以及其他影響因素，最終確定合適的純化條件。

②超濾

超濾法是利用加壓膜純化技術(shù)，在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過(guò)一定孔徑的特制薄膜，大分子溶質(zhì)滯留，從而使大分子物質(zhì)得到部分的純化。該法操作簡(jiǎn)便、成本低廉、試驗(yàn)條件溫和，不需加熱，與蒸發(fā)、冰凍干燥相比沒(méi)有相變化、pH變化，因而可以防止生物活性物質(zhì)的變性、失活和自溶。

③透析

透析是利用小分子經(jīng)過(guò)半透膜擴(kuò)散到水(或緩沖液)的原理，將無(wú)機(jī)鹽等小分子與生物大分子分開(kāi)的一種純化技術(shù)，常和鹽析、鹽溶等方法聯(lián)合使用。

2、基于溶解度差異的蛋白質(zhì)純化技術(shù)

①等電點(diǎn)法

等電點(diǎn)沉淀法是利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低且各種蛋白質(zhì)等電點(diǎn)不同的特點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)純化的方法。

②溶劑法

溶劑提取法包括水溶液提取法和有機(jī)溶劑提取法，其中緩沖溶液對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度大、穩(wěn)定性好，最為常用;而乙醇、丁醇和丙酮等有機(jī)溶劑具有一定的親水性和較強(qiáng)的親脂性，主要用于一些脂質(zhì)結(jié)合較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶。

其中乙醇提取法溶解性能較好、溶出的水溶性雜質(zhì)少、可回收反復(fù)利用。丁醇在一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶提取中更加優(yōu)越，溶解脂的能力強(qiáng)，兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)不會(huì)引起酶的變性失活。

③雙水相萃取法

雙水相萃取技術(shù)是一種新型的蛋白質(zhì)純化技術(shù)。它把兩種聚合物與一種鹽的水溶液混合在一起，由于聚合物與聚合物之間或聚合物與鹽之間的不溶性形成兩相，與傳統(tǒng)的純化蛋白質(zhì)純化相比，具有操作條件溫和、處理量大、易連續(xù)操作等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了常規(guī)萃取有機(jī)溶劑對(duì)生物物質(zhì)的變性作用，在粗提過(guò)程中保持了生物物質(zhì)的活性及構(gòu)象等優(yōu)勢(shì)。

該技術(shù)現(xiàn)已成功地應(yīng)用于純化蛋白質(zhì)、抗生素微生物離子、電泳純化氨基酸等。采用雙水相系統(tǒng)濃縮目的蛋白，受聚合物分子量及濃度、溶液pH、離子強(qiáng)度、鹽類型及濃度的影響。

反膠團(tuán)萃取是指膠團(tuán)內(nèi)可溶解少量水而形成微型水池，利用膠團(tuán)對(duì)外界有機(jī)溶劑的屏蔽作用，實(shí)現(xiàn)生物物質(zhì)的溶解和純化。該技術(shù)具有選擇性高、萃取過(guò)程簡(jiǎn)單，正萃、反萃同時(shí)進(jìn)行，能有效防止大分子失活、變性。其不足之處包括：普通離子型表面活性劑可能對(duì)產(chǎn)品產(chǎn)生污染;常用的離子型表面活性劑容易造成蛋白質(zhì)的變性和失活，雖然活性損失較少。其影響因素主要包括表面活性劑種類以及濃度、離子強(qiáng)度、助表面活性劑、水相pH和溫度等。反膠團(tuán)萃取法還可提取蛋白質(zhì)、酶、核酸、氨基酸和多肽。

④鹽溶法及鹽析法

許多蛋白質(zhì)在純水或低鹽溶液中溶解度較低，若稍加一些無(wú)機(jī)鹽則溶解度增加，該現(xiàn)象稱為鹽溶;而當(dāng)鹽濃度繼續(xù)增加時(shí)，蛋白質(zhì)又會(huì)自動(dòng)析出，該現(xiàn)象稱為鹽析。鹽溶和鹽析主要是通過(guò)影響蛋白質(zhì)分子表面的電荷而純化、純化蛋白質(zhì)。

鹽析法是粗純化蛋白質(zhì)的重要方法之一，常用硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉和硫酸銨等中性鹽。硫酸鈉具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、溶解度大等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在所指的鹽析法實(shí)際上多為硫酸銨鹽析法。該法受蛋白質(zhì)濃度、離子強(qiáng)度、鹽的性質(zhì)、pH及溫度等因素影響。

上述兩種方法純化蛋白質(zhì)后，都要采用凝膠過(guò)濾或透析除鹽。

3、基于電荷不同的蛋白質(zhì)純化技術(shù)

①離子交換層析

離子交換層析是發(fā)展最早的層析技術(shù)之一，目前已成為蛋白質(zhì)純化最常用的手段。離子交換層析以纖維素或交聯(lián)葡聚糖凝膠等物質(zhì)的衍生物為載體，在某一pH條件下，這些載體帶有正電荷或負(fù)電荷，當(dāng)待純化蛋白質(zhì)分子通過(guò)載體時(shí)，離子交換使蛋白質(zhì)分子純化。

②電泳技術(shù)

電泳技術(shù)作為純化蛋白質(zhì)的手段之一，無(wú)論是單向凝膠電泳還是雙向凝膠電泳，都是純化度極高的蛋白質(zhì)純化方法，可分為變性電泳、常規(guī)電泳、等電聚焦電泳和毛細(xì)管電泳。獲得純化的蛋白質(zhì)，均可用電洗脫或電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上直接進(jìn)行序列分析。

4、基于對(duì)配體親和力差異的蛋白質(zhì)純化技術(shù)

親和層析是一種以樣品的生物活性為依據(jù)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)。分析膜蛋白方法是利用蛋白質(zhì)能和某些專一分子可逆結(jié)合的特性而發(fā)展起來(lái)的層析技術(shù)。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液通過(guò)層析柱時(shí)，其中可與親和載體配基相互作用的受體被吸附劑結(jié)合，不被吸附的無(wú)關(guān)成分則可隨流出液通過(guò)柱體，從而將吸附蛋白與其他蛋白質(zhì)分開(kāi)，而后利用高濃度的底物溶液或親和力更強(qiáng)的底物衍生溶液洗脫目標(biāo)蛋白，即可脫離層析柱上的載體。

5、基于選擇性吸附差異的蛋白質(zhì)純化方法

疏水層析是利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性配基與流動(dòng)相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合的特性進(jìn)行純化。在高鹽溶液中，蛋白質(zhì)會(huì)與疏水配基相結(jié)合，其他的雜質(zhì)蛋白則無(wú)此種性質(zhì)，從而使蛋白質(zhì)初步純化。該方法具有使蛋白質(zhì)變性、僅適合部分蛋白質(zhì)等缺點(diǎn)。

6、其他蛋白質(zhì)純化方法

反相高效液相色譜法是一種以疏水作用為基礎(chǔ)的色譜純化法，具有分辨率高、重復(fù)性好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)，在蛋白質(zhì)及多肽的純化分析中得到了極其廣泛的應(yīng)用。

分子印跡是一種識(shí)別聚合物特殊結(jié)合位點(diǎn)的技術(shù)。隨著蛋白質(zhì)純化印跡聚合物的成功合成，蛋白質(zhì)印跡技術(shù)已成為研究熱點(diǎn)。

高效毛細(xì)管電泳技術(shù)是20世紀(jì)80年代問(wèn)世的一種高效液相蛋白質(zhì)純化技術(shù)，是經(jīng)典電泳技術(shù)與現(xiàn)代微柱蛋白質(zhì)純化相結(jié)合的產(chǎn)物。目前，它已成為分析科學(xué)中最具活力的方法之一，因其純化效率高、分析速度快、樣品用量少、抗污染能力強(qiáng)和易自動(dòng)化等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)以及高分子等多個(gè)領(lǐng)域。

作為蛋白質(zhì)產(chǎn)品純化的主流技術(shù)，柱層析具有很高的純化效率，通常采用固定床間歇操作方式，操作簡(jiǎn)單，但存在著載體利用率低和過(guò)程效率低的問(wèn)題。

采用連續(xù)逆流操作層析，蛋白質(zhì)純化效率和產(chǎn)率均有提高，對(duì)于難純化體系，逆流層析過(guò)程是一種有效蛋白質(zhì)純化手段。

純化蛋白質(zhì)的一般程序可以分為前處理，初級(jí)純化，高效純化，產(chǎn)品制備和貯存以及質(zhì)量檢測(cè)多個(gè)步驟。

1、前處理

純化蛋白，首先應(yīng)把蛋白質(zhì)從原來(lái)的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來(lái)，并保持原來(lái)的天然狀態(tài)，不丟失生物活性。

動(dòng)物材料應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織，種子材料應(yīng)先去殼甚至去種皮，以免受雜質(zhì)的污染。油料種子最好先采用低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑如乙醚等脫脂，然后根據(jù)不同的情況，選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。

細(xì)胞破碎的方法主要有四種：

一是機(jī)械破碎：它通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎，如搗碎法、研磨法和勻漿法。

二是物理破碎：通過(guò)各種物理因素作用，使組織細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎，包括溫度差破碎法、壓力破碎法和超聲波破碎法。

三是化學(xué)破碎：通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎。

四是酶促破碎：通過(guò)細(xì)胞本身酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞而達(dá)到細(xì)胞破碎，這類方法也稱為自溶法和外加酶制劑法。

細(xì)胞破碎后，選擇適當(dāng)緩沖液把所要的蛋白質(zhì)分離出來(lái)，并把細(xì)胞碎片等不溶物用離心或過(guò)濾的方法除去。離心分離除去細(xì)胞碎片和雜質(zhì)是常用的方法，它是通過(guò)借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)而產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)純化的技術(shù)過(guò)程。

在離心分離時(shí)，要根據(jù)擬分離蛋白質(zhì)以及雜質(zhì)顆粒的大小、密度和特性不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心的條件。下表所示為不同離心場(chǎng)下沉降的細(xì)胞組分。

2、粗分級(jí)純化

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)提取液(有時(shí)還摻雜有核酸、多糖之類)離心或過(guò)濾純化后，選用一套適當(dāng)?shù)姆椒?，將所要的蛋白質(zhì)與其他雜蛋白分離開(kāi)來(lái)。

這一步驟大多采用沉淀純化方法，這種方法是通過(guò)改變條件或添加某種物質(zhì)，使蛋白質(zhì)溶解度降低，而從溶液中沉淀與其他溶質(zhì)分離的過(guò)程。如下表列出了幾種常用的沉淀分離方法和原理。

3、高效分級(jí)純化

經(jīng)初級(jí)沉淀純化后，其目的蛋白質(zhì)純度增加至50%左右，也就是說(shuō)雜質(zhì)或其他非需要蛋白大部分被淘汰。根據(jù)目的蛋白純化度的要求，應(yīng)進(jìn)一步純化。

高效分級(jí)純化大都采用色譜層析純化技術(shù)。經(jīng)沉淀和濃縮的蛋白質(zhì)樣品一般經(jīng)2～4步色譜層析純化才能達(dá)到要求的蛋白純度。層析技術(shù)也稱為色譜技術(shù)，是一種物理純化方法。

高效分級(jí)純化是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，其中一個(gè)相為固定的(稱為固定相)，另一個(gè)相則流動(dòng)的(稱為流動(dòng)相)，并使各組分以不同速度移動(dòng)，從而達(dá)到純化目的。色譜層析方法按照其純化的原理可分六種類型(下表)。

因此，在蛋白質(zhì)純化設(shè)計(jì)過(guò)程中，應(yīng)根據(jù)目的蛋白特有的理化性質(zhì)來(lái)決定層析類型的取舍。

4、純化蛋白的干燥、結(jié)晶和儲(chǔ)存

濃縮與干燥都是蛋白質(zhì)與溶劑(通常是水)分離的過(guò)程，在蛋白質(zhì)的純化過(guò)程中是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。離心分離、過(guò)濾與膜分離、沉淀分離、層析分離等都能起到濃縮作用。用各種吸水劑，如硅膠、聚乙二醇、干燥凝膠等吸去水分，也可以達(dá)到濃縮效果。干燥方法有真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、氣流干燥和吸附干燥。

結(jié)晶是以晶體形式從溶液中析出的過(guò)程。蛋白質(zhì)的結(jié)晶是蛋白質(zhì)純化的一種手段。它不僅為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能等的研究提供了適宜的樣品，而且為較高純度的蛋白質(zhì)的獲得和應(yīng)用創(chuàng)造了條件。蛋白質(zhì)在結(jié)晶之前，必須經(jīng)過(guò)純化達(dá)到一定的純度。如果蛋白質(zhì)純度太低，不能進(jìn)行結(jié)晶。

通常的蛋白質(zhì)純度應(yīng)當(dāng)在50%以上，方能進(jìn)行結(jié)晶?？偟内厔?shì)是蛋白質(zhì)純度越高，越容易進(jìn)行結(jié)晶，有些蛋白質(zhì)在純度達(dá)到50%時(shí)就可以結(jié)晶，而有些在純度很好的條件下也無(wú)法析出結(jié)晶。所以，蛋白質(zhì)結(jié)晶并非達(dá)到絕對(duì)純化，只是達(dá)到相當(dāng)?shù)募兌榷选?/p>

純化蛋白貯存一般在為-20℃為宜，濃度太低往往造成蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)和構(gòu)型破壞，影響蛋白質(zhì)的生物活性。

5、蛋白質(zhì)的定量和定性分析

純化后的蛋白質(zhì)無(wú)論是作為實(shí)驗(yàn)室生物學(xué)研究還是工業(yè)化應(yīng)用，都應(yīng)進(jìn)行定量和定性分析。定量分析主要是指蛋白質(zhì)含量或蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定，常用的經(jīng)典方法有定氮法、雙縮脲法(Biuret法)、Folin-酚試劑法(Lowry法)和紫外吸收法。

蛋白質(zhì)的定性分析，一般包括分子量、等電點(diǎn)、蛋白質(zhì)純度、氨基酸序列等。蛋白質(zhì)分子量測(cè)定最常用的方法是SDS-PAGE凝膠電泳分析;等電聚焦電泳分析(isoelectrofocusing)常用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn);通常用于蛋白質(zhì)樣品純度測(cè)定的方法有物理化學(xué)法，如電泳、沉降、HPLC和溶解度分析等。

此外，生物化學(xué)分析法以利用生物活性、免疫學(xué)特性的方法也在純度測(cè)定中使用。對(duì)于不同用途的蛋白質(zhì)樣品應(yīng)根據(jù)所要求的不同純度，選用相宜的檢測(cè)方法。蛋白質(zhì)氨基酸序列分析已成為成熟的技術(shù)，大都利用氨基酸測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。