流式細(xì)胞術(shù)的歷史
概要說來,流式細(xì)胞術(shù)主要包括了樣品的液流技術(shù)、細(xì)胞的分選和計(jì)數(shù)技術(shù),以及數(shù)據(jù)的采集和分析技術(shù)等。FCM目前發(fā)展的水平凝聚了半個(gè)世紀(jì)以來人們?cè)谶@方面的心血和成果。
1934年,Moldavan1首次提出了使懸浮的單個(gè)血紅細(xì)胞等流過玻璃毛細(xì)管,在亮視野下用顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù),并用光電記錄裝置計(jì)測(cè)的設(shè)想,在此之前,人們還習(xí)慣于丈量靜止的細(xì)胞,由于要使單個(gè)細(xì)胞順次流過狹窄管道輕易造成較大的細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)塊的淤阻。1953年Crosland–Taylor根據(jù)雷諾對(duì)牛頓流體在圓形管中活動(dòng)規(guī)律的研究熟悉到:管中軸線流過的鞘液流速越快,載物通過的能力越強(qiáng),并具有較強(qiáng)的流體動(dòng)力聚集作用。于是設(shè)計(jì)了一個(gè)活動(dòng)室,使待分析的細(xì)胞懸浮液都集聚在圓管軸線四周流過,外層包圍著鞘液;細(xì)胞懸浮液和鞘液都在作層液。這就奠定了現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)中的液流技術(shù)基礎(chǔ)。
1956年,Coulter在多年研究的基礎(chǔ)上利用Coulter效應(yīng)生產(chǎn)了Coulter計(jì)數(shù)器。其基本原理是:使細(xì)胞通過一個(gè)小孔,只在細(xì)胞與懸浮的介質(zhì)之間存在著導(dǎo)電性上的差異,便會(huì)影響小孔道的電阻特性,從而形成電脈沖信號(hào),丈量電脈沖的強(qiáng)度和個(gè)數(shù)則可獲得有關(guān)細(xì)胞大小和數(shù)目方面的信息。1967年Holm等設(shè)計(jì)了通過汞弧光燈激發(fā)熒光染色的細(xì)胞,再由光電檢測(cè)設(shè)備計(jì)數(shù)的裝置。1973年Steinkamp設(shè)計(jì)了一種利用激光激發(fā)雙色熒光色素標(biāo)記的細(xì)胞,既能分析計(jì)數(shù),又能進(jìn)行細(xì)胞分選的裝置。這樣就基本完成了現(xiàn)代FCM計(jì)數(shù)技術(shù)的主要?dú)v程。
現(xiàn)代的FCM數(shù)據(jù)采集和分析技術(shù)是從組織化學(xué)起源的,其開拓者是Kamentsky。1965年,Kamentsky在組織化學(xué)的基礎(chǔ)上提出了兩個(gè)新設(shè)想:(1)細(xì)胞的組分是可以用光光度學(xué)來定量測(cè)定的,即分光光度術(shù)可以定量地獲得有關(guān)細(xì)胞組織化學(xué)的重要信息。(2)細(xì)胞的不同組分可以同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)丈量,從而可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類。換句話說,對(duì)同一細(xì)胞可以同時(shí)獲得有關(guān)不同組分的多方面信息,用作鑒別細(xì)胞的依據(jù)。
流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞化學(xué)中的應(yīng)用的先驅(qū)者是VanDilla和美國(guó)的LosAlamos小組。他們?cè)?967年研制出流液束、照明光軸、檢測(cè)系統(tǒng)光軸三者相互正交的流式細(xì)胞計(jì)的基礎(chǔ)上,首次用熒光Feulgen反應(yīng)對(duì)DNA染色顯示出DNA的活性與熒光之間存在著線性關(guān)系,并在DNA的直方圖上清楚地顯示出細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)相。Gohde和Dittrich接著把這項(xiàng)技術(shù)推向?qū)嵱?,他們用流式?xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期借以研究細(xì)胞藥代動(dòng)力學(xué)題目。FCM用于免疫組織化學(xué)中的關(guān)鍵是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色,其它和在細(xì)胞化學(xué)的應(yīng)用并沒有多大差異。(下圖為一DNA直方圖)
將待測(cè)細(xì)胞染色后制成單細(xì)胞懸液。
用一定壓力將待測(cè)樣品壓進(jìn)活動(dòng)室,不含細(xì)胞的磷酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出,鞘液管進(jìn)口方向與待測(cè)樣品流成一定角度,這樣,鞘液就能夠包繞著樣品高速活動(dòng),組成一個(gè)圓形的流束,待測(cè)細(xì)胞在鞘液的包被下單行排列,依次通過檢測(cè)區(qū)域。
流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過聚焦整形后的光束,垂直照射在樣品流上,被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下,產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。
(如下圖:FSC SSC)
前向角散射,即FSC與細(xì)胞直徑平分正相關(guān),所以我們平時(shí)上機(jī)的時(shí)候,有時(shí)用FSC做閾值,排除碎片及其它顆粒,避免干擾。
側(cè)向角散射,即SSC是指與激光束正交90度方向的散射信號(hào),它對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更敏感,可以提供細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)及顆粒性質(zhì)的信息!
因此,僅根據(jù)FSC/SSC,我們就可以分開全血樣本中的淋巴細(xì)胞,單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞!(如下圖)
這兩種信號(hào)同時(shí)被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收。光散射信號(hào)在前向小角度進(jìn)行檢測(cè),這種信號(hào)基本上反映了細(xì)胞體積的大小;熒光信號(hào)的接受方向與激光束垂直,經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離,形成多個(gè)不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)。
這些熒光信號(hào)的強(qiáng)度代表了所測(cè)細(xì)胞膜表面抗原的強(qiáng)度或其核內(nèi)物質(zhì)的濃度,經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號(hào),再通過模/數(shù)轉(zhuǎn)換器,將連續(xù)的電信號(hào)轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號(hào)。計(jì)算機(jī)把所丈量到的各種信號(hào)進(jìn)行計(jì)算機(jī)處理,將分析結(jié)果顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上,液可以打印出來,還可以數(shù)據(jù)文件的形式存儲(chǔ)在硬盤上以備日后的查詢或進(jìn)一步分析。(下圖為光學(xué)系統(tǒng))
檢測(cè)數(shù)據(jù)的顯示視丈量參數(shù)的不同由多種形式可供選擇。
單參數(shù)數(shù)據(jù)以直方圖的形式表達(dá),其X軸為丈量強(qiáng)度,Y軸為細(xì)胞數(shù)目。一般來說,流式細(xì)胞儀坐標(biāo)軸的分辨率有512或1024通道數(shù),這視其模數(shù)轉(zhuǎn)換器的分辨率而定。
對(duì)于雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù),既可以單獨(dú)顯示每個(gè)參數(shù)的直方圖(histogram),也可以選擇二維的散點(diǎn)圖(dotplot)、等高線圖(contour)或三維立體視圖(pseudo3D)。
(上面有一個(gè)直方圖了,下圖為散點(diǎn)圖及三維立體圖)
細(xì)胞的分選是通過分離含有單細(xì)胞的液滴而實(shí)現(xiàn)的。在活動(dòng)室的噴口上配有一個(gè)超高頻電晶體,充電后振動(dòng),使噴出的液流斷裂為均勻的液滴,待測(cè)定細(xì)胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負(fù)不同的電荷,當(dāng)液滴流經(jīng)帶有幾千伏特的偏轉(zhuǎn)板時(shí),在高壓電場(chǎng)的作用下偏轉(zhuǎn),落進(jìn)各自的收集容器中,不予充電的液滴落進(jìn)中間的廢液容器,從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分離。也就是高中學(xué)過的帶電粒子在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)的原理!