離子交換色譜是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測(cè)定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法進(jìn)行分離。離子交換色譜技術(shù)常被用于蛋白質(zhì)、寡核苷酸、多肽、病毒、噬菌體、多糖等的純化。

離子交換色譜是將離子交換基因（CM、SP、Q、DEAE等）鍵合于一定的惰性載體（纖維素、交聯(lián)葡聚糖，交聯(lián)瓊脂糖等）之上，并以此作為固定相，依據(jù)樣品所帶電荷的不同，從而與固定相上的離子交換基團(tuán)相互作用的程度不同而進(jìn)行分離的一種色譜方法。

離子交換劑是在載體上鍵合了一些離子交換基團(tuán)，而離子交換基團(tuán)在水溶液中通過電離釋放出游離的離子，這些離子可帶正電或帶負(fù)電，可以被溶液中的其它帶相同電荷的離子取代，并對(duì)離子交換劑有較強(qiáng)的結(jié)合力。結(jié)合力的大小不僅受離子與離子交換劑之間作用力的影響，而且主要受離子濃度的影響，這個(gè)過程中的作用力是靜電引力，離子交換的原理是靜電相互作用。

以蛋白質(zhì)分離純化為例：由于蛋白質(zhì)有等電點(diǎn)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來，結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來，從而達(dá)到分離提純的作用。

蛋白質(zhì)在離子交換色譜上的保留時(shí)間取決于蛋白質(zhì)在相應(yīng)色譜條件下所帶靜電荷的多少，而蛋白質(zhì)所帶靜電荷的多少是由蛋白質(zhì)分子的pI和所處溶液環(huán)境的pH共同決定的。在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電荷；在堿性條件下，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷。在陽離子交換柱上，只有pI大于流動(dòng)相pH的蛋白質(zhì)在柱子上保留，而pI小于或等于流動(dòng)相pH的蛋白質(zhì)不保留，即使它們的pI值彼此之間有差異，也都作為溶劑峰同時(shí)被直接沖洗出來。而被保留的蛋白質(zhì)出峰順序則是pI小的先出峰，pI大的后出峰。在陰離子交換柱上情況則恰恰相反。

絕大多數(shù)重組蛋白純化都要用到離子交換。離子交換色譜的基礎(chǔ)是高分辨率，可以直接放大規(guī)模應(yīng)用在工業(yè)上，柱再生容易，還可以使蛋白濃縮。大多數(shù)蛋白質(zhì)的靜電荷是負(fù)值，因此陰離子交換色譜的應(yīng)用最為廣泛。

介質(zhì)的選擇

離子交換介質(zhì)首先要考慮目的分子的大小，因?yàn)槟康姆肿訒?huì)影響其接近介質(zhì)上的帶電功能集團(tuán)，因此也會(huì)影響介質(zhì)對(duì)目的分子的動(dòng)力載量，從而影響其分離。

對(duì)于大多數(shù)純化步驟來說，建議從開始的階段使用強(qiáng)離子交換柱，可在摸索方法的過程中有一個(gè)寬的pH范圍。對(duì)于已知等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)，可根據(jù)其等電點(diǎn)來選擇。而未知等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)，在實(shí)際操作中常采用這樣的方法，先選擇一個(gè)陰離子交換劑，再選擇一個(gè)中性的pH緩沖液，將蛋白質(zhì)樣品透析至pH7.0，然后過陰離子交換柱。根據(jù)過柱后的結(jié)果確定下一個(gè)使用的緩沖液pH。

流動(dòng)相的選擇

離子交換色譜的流動(dòng)相必需是有一定離子強(qiáng)度的并對(duì)pH有一定緩沖能力的溶液。為了避免目的蛋白失活，使用緩沖液可穩(wěn)定流動(dòng)相的pH，使之在色譜過程中不發(fā)生明顯變化，同時(shí)可穩(wěn)定目的分子上的電荷量，保證色譜結(jié)果的重要性。

選擇緩沖液一般按照以下原則：陽離子交換劑應(yīng)選用陰離子緩沖液，可用檸檬酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、甘氨酸鹽等；陰離子交換劑應(yīng)選用陽離子緩沖液，可用烷基胺、Tris、氨基乙醇胺、乙二胺、咪唑等；起始緩沖液的濃度應(yīng)盡可能低（ 100mmol/L）這樣可以使色譜柱上更多的吸附分離物質(zhì)；緩沖液應(yīng)不含會(huì)影響被分離物質(zhì)活性和溶解度成分，洗脫時(shí)盡量不采用pH梯度洗脫。

色譜柱的選擇

離子交換色譜通常選用粗短柱，即高徑比小的色譜柱。典型的離子交換柱高度在5~20cm，高徑比一般小于5。如果需要增加離子交換劑的體積，只能從增加柱的直徑而不能增加其高度。如果是連續(xù)梯度洗脫，可以適當(dāng)增加柱的長(zhǎng)度。

a.  樣品的預(yù)處理

b.  樣品的平衡

將實(shí)驗(yàn)一中50%飽水硫酸銨沉淀、離心得到的上清液，置于透析袋中，于20～40倍體積的pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA的緩沖液中，4℃攪拌透析24 h，中間換透析液3～4次，4℃ 12 000 rpm離心15 min，收集上清，測(cè)定蛋白濃度，記錄體積。

c.  陰離子柱Q-Sepharose FF的平衡及上樣

取陰離子交換基質(zhì)Q-Sepharose FF裝柱，柱體積5.4×20 cm用pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl 1 mmol/L EDTA 緩沖液流洗平衡層析柱，調(diào)整好蛋白檢測(cè)儀的量程及記錄儀靈敏度。將收集的上清液以8 ml/min流速上樣。平衡緩液沖直至流出液吸光值恢復(fù)至基線。收集穿過峰，量體積，測(cè)蛋白含量。

d.  洗脫

洗脫液A為pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA緩沖液，洗脫液B為含終濃度為1 mol/L NaCl的A液進(jìn)行線性梯度洗脫（根據(jù)純化條件設(shè)定的純化工藝），收集各洗脫峰量體積，測(cè)蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE或進(jìn)行活性鑒定TNF所在峰。

e  將活性峰用pH7.5 20 mmol/L PB透析24 h，中間換液3次。離心，取上清并量其體積，測(cè)蛋白濃度。

f.  陽離子柱SP-Sepharose FF的平衡及上樣

取陽離子交換基質(zhì)SP-Sepharose FF裝柱，柱體積2.5×10 cm，用pH7.5 20 mmol/L PB緩沖液流洗平衡層析柱，調(diào)整好蛋白檢測(cè)儀的量程及記錄儀的靈敏度，將透析、離心后的TNF的峰液以4 ml/min的流速上樣，用平衡液洗至基線，收集穿過峰，量體積，測(cè)蛋白濃度。

g.  洗脫

陽離子層析柱SP-Sepharose FF的洗脫液A為pH7.5 20 mmol/L PB，洗脫液B為含1 mol/L NaCl的A液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集各洗脫峰，量體積，測(cè)蛋白質(zhì)濃度，進(jìn)行SDS-PAGE或活性鑒定。

h.  后處理

進(jìn)行TNF的純度、活性等鑒定，按要求分裝加賦形劑冷凍干燥后制成一定效價(jià)的TNF產(chǎn)品。