培養(yǎng)基，是指供給微生物、植物或動物(或組織)生長繁殖的，由不同營養(yǎng)物質組合配制而成的營養(yǎng)基質。培養(yǎng)基配成后一般需測試并調節(jié)pH，還須進行滅菌，通常有高溫滅菌和過濾滅菌。培養(yǎng)基由于富含營養(yǎng)物質，易被污染或變質。配好后不宜久置，最好現(xiàn)配現(xiàn)用。

一、培養(yǎng)基配制和滅菌原理

1、培養(yǎng)基是提供微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。因為不同的微生物對營養(yǎng)物質的要求各不相同，加之實驗和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多。雖然種類很多，但是培養(yǎng)基中一般含有必需的碳源、氮源、無機鹽以及水分等，另外，培養(yǎng)基還應有適宜的pH。

2、瓊脂是應用最廣泛的凝固劑，加瓊脂制成的培養(yǎng)基在98-100℃下融化，45℃以下凝固。然而，如果瓊脂多次反復融化，其凝固性就會降低。

3、任何一種培養(yǎng)基一旦制成必須及時滅菌。一般培養(yǎng)基滅菌采用高壓蒸汽滅菌。

二、配制最普通的細菌培養(yǎng)基

1、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用廣泛和最普通的細菌培養(yǎng)基(普通培養(yǎng)基)，它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl，其中牛肉膏為微生物提供了碳源和能量，蛋白胨主要提供了氮源，而NaCl提供了無機鹽。因為這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細菌，所以要用稀酸或稀堿將其pH調到7.2-7.4，以利于細菌的生長。

2、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方

牛肉膏：3g;蛋白胨：10g;NaCl：5g;水：1000mL;pH：7.2-7.4;瓊脂：15-20g。

3、儀器與試劑

牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、質量分數(shù)為10%的鹽酸、質量分數(shù)為10%的氫氧化鈉、燒杯、三角燒瓶、量筒、玻璃棒、玻璃漏斗、酒精燈、培養(yǎng)皿、牛皮紙、繩、天平、牛角匙、精密pH試紙、滅菌鍋、超凈工作臺等。

4、步驟

(1)稱量

根據(jù)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方依次準確稱取各種藥品，放入適當大小的燒杯中。牛肉膏放在小燒杯里稱量，用熱水融化后倒入大燒杯中。蛋白胨易潮濕，稱量要快。

應注意的是，1把牛角匙用于1種藥品，藥瓶蓋不要蓋錯。瓊脂稱好后不要急于加入到其他藥品中。

(2)融化

在大燒杯中先加少于所需要的水量，把稱好的各種原料成分按照配方依次加入到大杯中(牛肉膏可用50mL燒杯稱量，并用少許熱水溶解后再加入大燒杯中)，用玻璃棒攪勻，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解，等所有加入的原料全部溶解后，補充水分到所需的體積。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種固體培養(yǎng)基，需要加瓊脂使其凝固。大燒杯用酒精燈加熱至沸騰后加入瓊脂，繼續(xù)加熱至瓊脂完全融化(在加熱過程中要用玻璃棒不斷攪拌，以防瓊脂沸騰溢出或瓊脂糊底導致燒杯破裂)。

最后補足所蒸發(fā)的水分。應注意的是，培養(yǎng)基中的各種無機鹽可能相互作用產(chǎn)生沉淀，因此在混合培養(yǎng)基成分時，一般是按配方的順序依次溶解各成分，甚至有時還需要將2種或多種成分分別滅菌，使用時再按比例混合。

(3)調節(jié)pH

根據(jù)培養(yǎng)基對pH的要求，用質量分數(shù)為10%的鹽酸或質量分數(shù)為10%的氫氧化鈉溶液調至所需pH。測定pH可用精密pH試紙或酸度計等。

在未調pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH，如果pH偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入質量分數(shù)為10%的氫氧化鈉溶液，邊加邊攪拌，并隨時用精密pH試紙測其pH，直至pH達7.2-7.4。反之，用10%鹽酸溶液調節(jié)。應注意的是，pH不要調過頭，以免回調影響培養(yǎng)基內各離子的質量分數(shù)。

(4)過濾

如果是液體培養(yǎng)基，就要在玻璃漏斗中放一層濾紙;如果是固體培養(yǎng)基或半固體培養(yǎng)基，則需在漏斗中放多層紗布或2層紗布夾1層薄薄的脫脂棉趁熱過濾。若無特殊要求，這一步就可以省去。

(5)分裝

如下圖所示，采用該分裝器分裝時不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口，以免引起污染。

應注意的是，液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜;固體分裝的量一般為管高的1/5;半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜;分裝三角瓶，其裝量以不超過三角瓶容積的一半為宜。

(6)包扎標記

培養(yǎng)基分裝好后加好棉塞或試管帽，再包上一層防潮紙(筆者實驗時用牛皮紙)，并用棉線包扎好。在分裝好的瓶上貼上標簽，寫清培養(yǎng)基名稱、組別、配制時間等。

(7)滅菌(下文有詳細介紹)

(8)擱置斜面

將分裝在試管內的培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50℃，將試管有棉塞端擱在玻璃棒上，擱置的試管斜面長度以不超過試管總長度的一半為宜。

(9)無菌檢查

將滅菌的培養(yǎng)基放在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24-48h，檢查滅菌是否徹底。

三、培養(yǎng)基滅菌

1、定義：用理化方法殺死一定物質中的微生物的微生物學基本技術。

2、生物學中最常見的滅菌方法：干熱滅菌，濕熱滅菌。

(1)干熱滅菌

干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內的蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。干熱滅菌有火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌2種。細胞內蛋白質的凝固性與其自身含水量有關，在菌體受熱時，當環(huán)境和細胞內含水量越大時，則蛋白質凝固就越快，反之凝固緩慢。

與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度要高(160-170℃)，時間要長(1-2h)，但干熱滅菌溫度不能超過180℃，否則，包器皿的紙或棉塞就會烤焦，甚至引起燃燒。

(2)濕熱滅菌(最常見的是高壓蒸汽滅菌)

含水量越高，蛋白質凝固所需要的溫度就越低。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因為在濕熱情況下，菌體吸收水分，使蛋白質易于凝固。同時濕熱的穿透力強，可增加滅菌效力。

3、高壓蒸汽滅菌是滅菌效果最好、目前應用最廣的滅菌方法，是微生物學實驗中最常見的滅菌方法。

(1)高壓蒸汽滅菌簡介

高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇將鍋內冷空氣從排氣閥中驅盡時，關閉排氣閥，繼續(xù)加熱。由于水蒸汽無法排出，增加了滅菌鍋內的壓力，從而使沸點增高，得到高于100℃的溫度，導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。

一般培養(yǎng)基在1.05kg/cm2、溫度為121℃的情況下維持15-30min可達到徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質和容量等具體情況而有所改變。

(2)高壓蒸汽滅菌的操作過程和注意事項

①加水。打開滅菌鍋蓋，向鍋內加水到水位線。應注意的是，水要加夠，防止在滅菌過程中干鍋。

②裝料、加蓋。裝料擺放平整(實踐證明這一環(huán)節(jié)非常重要)。材料放好后，蓋滅菌鍋，采用對角線均勻擰緊鍋蓋上的螺絲，使蒸汽鍋密封，勿漏氣。

③排氣。打開排氣口(放氣閥)，用電加熱，待水煮沸后，水蒸汽和空氣一起從排氣孔排出，當有大量蒸汽排出時，維持5min，使鍋內的冷空氣完全排凈。

④升壓、保壓、降壓。當鍋內冷空氣排凈后，關閉排氣閥，壓力開始上升。當壓力上升到所需壓力1.05kg/cm2時(可用旋鈕調節(jié)壓力)，控制壓力以維持恒溫121℃，并開始計算滅菌時間(調節(jié)滅菌時間按鈕20min即可)。滅菌結束后拔掉電源，當壓力降至“0”時，打開放氣閥。應注意的是，不能過早打開放氣閥，否則會由于瓶內壓力下降的速度比鍋內的慢而造成瓶內液體沖出容器之外。

⑤滅菌后的培養(yǎng)基空白培養(yǎng)。滅菌后的培養(yǎng)基應放于37℃恒溫箱中培養(yǎng)，經(jīng)驗證24-48h無菌生長后才可保存?zhèn)溆谩?/p>