過氧化氫酶(又稱觸酶)，是一類廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi)的末端氧化酶，其生物學(xué)功能是催化細胞內(nèi)過氧化氫分解為H2O與O2，阻抑H2O2生成有害的·OH。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和社會的進步，過氧化氫酶(CAT)的用途越來越廣泛。目前紡織業(yè)應(yīng)用強氧化劑過氧化氫漂白脫色，而多余的過氧化氫可用過氧化氫酶去掉，以符合于環(huán)保的要求。醫(yī)學(xué)上也可用低濃度過氧化氫清除壞死組織，然后再用過氧化氫酶反應(yīng)多余的過氧化氫。葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶復(fù)合制劑還可用于防治動物腸道、胃部由細菌引起的一些疾病。因此過氧化氫酶的酶活力測定對于研究和應(yīng)用此酶顯得十分重要。

過氧化氫酶測定方法主要有碘量法、紫外吸收法、熒光分析法、化學(xué)發(fā)光法、極譜氧電極法、簡易氣量測定法等，基于過氧化氫易分解，所以直接檢測過氧化氫來表示過氧化氫酶活性的測定方法準(zhǔn)確度不高。

一、不同植物過氧化氫酶活性

(一)材料與方法

試驗材料選用6種較為普遍種植的葉菜類蔬菜，包括普通葉菜類的香芹、小白菜、紅菜苔、上海青;結(jié)球葉菜類的包心菜;辛香葉菜類的芫茜。采用紫外分光光度法測定和計算過氧化氫酶活性;將第1天試驗后剩余蔬菜置于常溫25℃環(huán)境下儲存至第2天、第3天，提取粗酶液后測定每種蔬菜過氧化氫酶活性的變化。

(二)結(jié)果與分析

1、6種蔬菜不同部位過氧化氫酶活性

由下圖可知，在相同環(huán)境條件處理下，6種蔬菜各個部位的過氧化氫酶活性各有高低，其中最高的為紅菜苔葉，過氧化氫酶活性為219.06U/gFW/min;其次是小白菜葉為199.68U/gFW/min，最低為芫茜葉為83.43U/gFW/min。各種蔬菜莖的過氧化氫酶活性普遍比其葉的過氧化氫酶活性低，最高為芫茜莖為66.09U/gFW/min，其次為小白菜莖為41.25U/gFW/min，最低為紅菜苔莖為13.43U/gFW/min。葉與莖過氧化氫酶活性差別最大的是紅菜苔，葉與莖過氧化氫酶活性差別最小的是芫茜。

2、6種蔬菜過氧化氫酶活性隨貯藏時間的變化

①上海青

上海青葉和莖同處上升趨勢。上海青葉過氧化氫酶活性從第1天到第2天增幅為24%，第2天到第3天增幅為34.5%;上海青莖過氧化氫酶活性從第1天到第2天的增幅很小，第2天到第3天上升約93.7%，見下圖。

②小白菜

小白菜葉在經(jīng)歷第2天小幅上升后，第3天開始下降，從第2天到第3天下降約18%，小白菜莖過氧化氫酶活性則從第2天開始緩慢下降，到第3天下降幅度繼續(xù)增大，從第2天到第3天下降約53%，見下圖。

③香芹

香芹葉子的過氧化氫酶活性在第2天下降至59.22U/gFW/min，下降約40%，到第3天繼續(xù)下降至34.68U/gFW/min，過氧化氫酶活性下降約41%，在2天的貯存期間下降幅度相近，保持穩(wěn)定的下降趨勢，表示葉子在逐漸衰老;香芹莖中過氧化氫酶活性在第2天小幅上升了19%后，至第3天回落，總體呈現(xiàn)逐漸衰老趨勢，如下圖所示。

④芫茜

從下圖可見，芫茜葉在第2天上升約54%后至第3天緩慢下降;而芫茜莖過氧化氫酶活性則一直處于下降，第2天過氧化氫酶活性已下降到38.28U/gFW/min，第3天經(jīng)歷小幅下降。

⑤紅菜苔

從下圖可以得出，紅菜苔葉過氧化氫酶活性起點很高，在測定的3天中變化不大，呈緩慢上升趨勢;紅菜苔莖則在經(jīng)歷了第2天緩慢上升后在第3天上升幅度較大，從第2天到第3天增幅約188%。

⑥包菜

下圖表明，包菜的葉和莖變化曲線相似，呈緩慢上升趨勢，包菜葉過氧化氫酶活性3天中增幅為36%;包菜莖從第2天到第3天的過氧化氫酶活性增幅為99%。

⑦6種蔬菜葉過氧化氫酶活性變化

從下圖可知，紅菜苔葉、包菜葉、芫茜葉、上海青葉從第1天到第3天的過氧化氫酶活性變化總體為升高的趨勢，而小白菜葉、香芹葉由第1天到第3天的過氧化氫酶活性變化總體為下降趨勢。

⑧6種蔬菜莖過氧化氫酶活性變化

由下圖得出，芫茜莖、小白菜莖、香芹莖由第1天到第3天的過氧化氫酶活性變化總體為降低趨勢。但上海青莖、包菜莖、紅菜苔莖從第1天到第3天的過氧化氫酶活性變化總體為上升的趨勢。

(三)討論

在環(huán)境條件相同且常溫儲藏中，不同的蔬菜因品種的不同過氧化氫酶活性變化不同，大致可分為3種：①逐漸下降;②單峰曲線;③末段上升。因蔬菜最佳的儲存食用期為3天，因此本試驗設(shè)計的天數(shù)也為3天期限。

紅菜苔、上海青、小白菜都屬于普通葉菜類蔬菜，它們的過氧化氫酶活性普遍都較高，因此較耐貯藏;包心菜屬于結(jié)球類葉菜其過氧化氫酶活性與普通葉菜類蔬菜相當(dāng);而芫茜則屬于辛香葉菜類，過氧化氫酶活性較其他種葉菜類低，但同樣遵循葉比莖的過氧化氫酶活性高的規(guī)律。在本試驗中符合此特性的有芫茜葉、上海青、紅菜苔、包菜。

從這些蔬菜的過氧化氫酶變化規(guī)律可看出，它們在經(jīng)歷了活性氧失衡的臨界點后過氧化氫酶活性才逐步下降并衰老，臨界點集中出現(xiàn)在蔬菜采后的第2天、第3天。因此果蔬采后保鮮技術(shù)的研究可從如何維持第2天、第3天的活性氧代謝水平方向研究，也可考慮從采后2天或3天的蔬菜中提取高活性過氧化氫酶用作工業(yè)用途。

蔬菜的葉和莖受逆境影響程度不同，有的蔬菜葉較易受逆境因素激發(fā)影響，活性氧在有利范圍內(nèi)增加，如上海青葉、芫茜葉，而有的蔬菜莖較易激發(fā)，如紅菜苔莖、包菜莖。與別的蔬菜種類比較起來香芹較難貯藏，在普通環(huán)境中無任何處理，香芹貯藏就會迅速衰老，而其他蔬菜如上海青、包菜、小白菜即使對它們不作任何保鮮處理，在普通環(huán)境中貯藏，其過氧化氫酶活性依然會上升，起到延緩其衰老腐敗的作用，使這些蔬菜較易貯藏。

(四)結(jié)論

1、從6種蔬菜的葉和莖兩個部位中提取出來的過氧化氫酶活性表明，葉過氧化氫酶活性普遍較高，而莖則普遍較低;各蔬菜之間、品種之間、部位之間活性相差也較大。

2、6種蔬菜過氧化氫酶活性隨貯藏時間的變化規(guī)律，從第1天到第3天的葉與莖過氧化氫酶活性變化總體為升高趨勢的有紅菜苔葉莖、包菜葉莖、上海青葉莖、芫茜葉;由第1天到第3天的葉與莖過氧化氫酶活性變化總體為下降趨勢的有小白菜葉莖、香芹葉莖、芫茜莖。

3、蔬菜采后活性氧代謝失衡點普遍出現(xiàn)在第2、3天間，因此只要采取適宜的保鮮措施，即使采后2～3天依然能在一定程度上保持其食用及味道。

二、分光光度法測定植物過氧化氫酶活性

(一)材料與方法

1、試驗儀器：紫外分光光度計;離心機;研缽;容量瓶;吸管;試管;恒溫水浴鍋。

2、試劑：0.2 mol/L pH7.8磷酸緩沖液(內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮);0.1 mol/L H2O2(用0.1 mol/L高錳酸鉀標(biāo)定)。

3、方法：以從小麥葉片中提取的過氧化氫酶活性的測定為例(從豌豆、黃瓜中提取和測定過氯化氫酶活性參照小麥葉片的測定)。

①酶液提?。悍Q取新鮮小麥葉片0.5g置研缽中，加入2-3ml 4℃下預(yù)冷的pH=7.0磷酸緩沖液和少量石英砂研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，并用緩沖液沖洗研缽數(shù)次，合并沖洗液，并定容到刻度。混合均勻?qū)⒘科恐?℃冰箱中靜置10min，取上清液在4000rpm下離心15min，上清液即為過氧化氫酶粗提液。5℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

②活力測定：取10ml試管3支(S1、S2、S3)，其中(S1、S2)為樣品測定管，(S3)為空白管，按下表順序加入試劑，重復(fù)3次。

25℃預(yù)熱后，逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即記時，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下測定吸光度，每隔1min讀數(shù)1次，共測4min，待3支管全部測定完后，按下式計算酶活性。

③結(jié)果計算：以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個酶活單位(U)。

過氧化氫酶(A)活性(U/gFW/min)=ΔA240×VT/(0.1×V1×t×FW)

A240=AS0﹣(AS1+AS2)/2

AS0：加入煮死酶液的對照管吸光值;

AS1，AS2：樣品管吸光值;

VT：粗酶提取液總體積(ml);

V1：測定用粗酶液體積(ml);

FW：樣品鮮重(g);

0.1-A240：每下降0.1為1個酶活單位(U);

t：加過氧化氫到最后一次讀數(shù)時間(min)。

(二)結(jié)果與分析

從小麥葉片、豌豆和黃瓜中提取的過氧化氫酶活性的測定結(jié)果見下表。

從試驗得出的數(shù)據(jù)可以看到第1分鐘得出的結(jié)果是從黃瓜中提取的過氧化氫酶的活性最大，小麥次之，最后是豌豆。第2分鐘、第3分鐘、第四分鐘得到的結(jié)果和第1分鐘一樣，也是從黃瓜中提取的過氧化氫酶的活性最大，小麥次之，最后是豌豆。

(三)結(jié)論與討論

本試驗主要研究從3種植物中，在質(zhì)量相同的情況下哪種植物可以提取更多的過氧化氫酶。由于這3個反應(yīng)都是過氧化氫的分解反應(yīng)，在其他的條件相同的情況下過氧化氫酶的量多的反應(yīng)速度就快，反應(yīng)進行的越快則過氧化氫酶的活性就越大。

從最后試驗得出的數(shù)據(jù)可以看到黃瓜中提取的過氧化氫酶的活性最大，小麥次之，最后是豌豆。在質(zhì)量相同的情況下在這3種植物中從黃瓜中可以提取更多的過氧化氫酶，小麥次之，最后是豌豆。

三、水楊酸法測定植物過氧化氫酶活性

(一)材料與方法

1、儀器與試劑

新鮮的土豆、黃瓜、生菜、蘋果、梨，均購于本地華美超市。雙氧水30%、硫酸亞鐵、水楊酸、石英砂。本實驗所用試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。水樣來自實驗室自來水。

UV-2550紫外可見光譜儀，數(shù)顯恒溫水浴鍋。

2、實驗方法

①過氧化氫的標(biāo)準(zhǔn)曲線

取6支10mL比色管，分別向其中加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1mL過氧化氫溶液(0.003%)，再向各管內(nèi)加入1mL pH=1的硫酸、4mL硫酸亞鐵溶液(1×10-3mol/L)、2mL水楊酸溶液(1×10-2mol/L)，用蒸餾水定容到刻度線，混勻。在40℃水浴鍋內(nèi)保溫10分鐘后，在波長510nm下測定吸光值，記為A。以過氧化氫的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。

②酶液的提取

稱取新鮮被測植物組織0.5g，置于研缽中，加入少量石英砂和2～3mL蒸餾水，充分研磨成勻漿后，轉(zhuǎn)入25mL容量瓶內(nèi)，并用蒸餾水沖洗數(shù)次研缽，合并沖洗液，并定容到刻度線，混勻后放置在5℃冰箱內(nèi)靜置10分鐘。在4000r/min下離心15分鐘，上清液即為過氧化氫酶粗提液，于5℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

③酶活性測定

取4支10mL比色管，分別加入1mL過氧化氫酶粗提液液，在25℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱10分鐘后，逐管加入1mL過氧化氫溶液(0.003%)，在25℃下保溫。

每隔1分鐘取出一支比色管，迅速加入1mL pH=1的硫酸，終止反應(yīng)。再向管內(nèi)加入4mL硫酸亞鐵溶液和2mL水楊酸溶液，用蒸餾水定容到10mL，混勻，放在40℃水浴鍋內(nèi)保溫10分鐘。然后在波長510nm下測定吸光值，記為AS1、AS2、AS3、AS4，對照組不加過氧化氫的其余組分溶液，每隔1min測其吸光度，共測3次，取平均值記為Ab，并計算ΔA(ΔA=AS-Ab)。

④酶活性的計算方法

土豆過氧化氫酶的活性計算方法：

Kf=k×(25mL/1mL)×(1/0.5g)

其中，Kf為過氧化氫酶活性值μg/min;k為ln(X0/X)，表示植物組織中過氧化氫酶分解過氧化氫的速率;25mL為植物過氧化氫酶粗提液總體積，1mL為反應(yīng)液中酶液的加入量，0.5g為稱取植物組織的質(zhì)量。

3、統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用origin8.0軟件處理，并用SPSS17.0軟件包進行差異顯著性分析(P 0.05)。

(二)結(jié)果與討論

1、線性關(guān)系的考察

按標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：y=0.0166x+0.0036，R2=0.9992，過氧化氫濃度在0～33.670μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2、硫酸亞鐵濃度雙氧水檢測的影響

取7支10mL比色管，按酶活性測定的實驗方法，保持其它條件不變(1mL過氧化氫溶液、2mL水楊酸溶液、pH=1的硫酸1mL、反應(yīng)時間為10min、反應(yīng)溫度為40℃)，只改變硫酸亞鐵溶液為2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5mL，考察硫酸亞鐵濃度雙氧水檢測的影響，見下圖。

結(jié)果表明，在測定羥自由基時，硫酸亞鐵的最佳加入量為4mL。

3、水楊酸濃度對雙氧水檢測的影響

取6支10mL比色管，按酶活性測定的實驗方法，保持其它條件不變(1mL過氧化氫溶液、4mL硫酸亞鐵溶液、pH=1的硫酸1mL、反應(yīng)時間為10分鐘、反應(yīng)溫度為40℃)只改變水楊酸溶液的體積為0.5、1、1.5、2、2.5、3mL，考查水楊酸濃度對雙氧水檢測的影響，結(jié)果如下圖。

結(jié)果表明，在測定羥自由基時，水楊酸溶液的最佳加入量為2mL。

4、pH對雙氧水檢測的影響

取6支10mL比色管，按酶活性測定的實驗方法，保持其它條件不變(1mL過氧化氫溶液、4mL硫酸亞鐵溶液、2mL水楊酸溶液、反應(yīng)時間為10分鐘、反應(yīng)溫度為40℃)只改變硫酸溶液的pH=1，2，3，4，5，6各1mL考查pH對雙氧水檢測的影響，結(jié)果如下圖。

結(jié)果表明，在測定雙氧水時，加入pH=1的硫酸1mL效果最佳，用pH計測定，pH位1.2，pH=1.0可以終止過氧化氫和過氧化氫酶的方法，本試驗選擇pH=1.2的硫酸溶液1mL。

5、時間對雙氧水檢測的影響

取6支10mL比色管，按酶活性測定的實驗方法，保持其它條件不變(1mL過氧化氫溶液、4mL硫酸亞鐵溶液、2mL水楊酸溶液、反應(yīng)溫度為40℃)只改變反應(yīng)時間為2、4、6、8、10、12、15min，考查反應(yīng)時間對雙氧水檢測的影響，結(jié)果如下圖。

結(jié)果表明，在測定雙氧水時，最佳反應(yīng)時間為10分鐘。

6、溫度對雙氧水檢測的影響

取6支10mL比色管，按酶活性測定的實驗方法，保持其它條件不變(1mL過氧化氫溶液、4mL硫酸亞鐵溶液、2mL水楊酸溶液、反應(yīng)時間為10分鐘)只改變反應(yīng)溫度20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃。考查溫度對雙氧水檢測的影響，結(jié)果如下圖。

結(jié)果表明，在測定雙氧水時，最佳反應(yīng)溫度為40℃。

7、酶活性的測定

分別取處理后的樣品土豆、黃瓜、生菜、蘋果、梨0.5g，按上文的方法提取，加入過氧化氫X0為33.670μg，按酶活性測定的實驗方法測定△A，計算ln(X0/X)，以時間t為橫坐標(biāo)，ln(X0/X)為縱坐標(biāo)作圖求的回歸方程，根據(jù)上文的試驗方法計算反應(yīng)速率k和過氧化氫酶酶活K，實驗數(shù)據(jù)見下表。

用紫外分光光度法直接測定土豆、黃瓜、生菜、蘋果、梨五種蔬菜水果的過氧化氫酶活性，所得數(shù)據(jù)分別為4.87±3.5、1.02±3.2、4.21±0.8、1.45±1.5、2.40±6.7μg/min，統(tǒng)計分析表明，過氧化氫酶活沒有顯著性差異，新方法適用于蔬菜水果中過氧化氫酶活的測定。

(三)結(jié)論

利用水楊酸法測定不同植物中過氧化氫酶活性的新方法，加入硫酸既可以終止過氧化氫酶分解過氧化氫，又滿足水楊酸法測定過氧化氫的反應(yīng)條件，同時簡化了反應(yīng)體系。對五種植物組織中過氧化氫酶進行測定，結(jié)果與紫外吸收光譜法比較，無顯著性差異，但本法重現(xiàn)性好，檢出線低，選擇性好，適合于蔬菜水果中過氧化氫酶活的測定。