1979年,瑞士米歇爾弗雷德里希生物研究所(Friedrich Miescher Institute)的Harry Towbin提出了蛋白質(zhì)印跡法。1981年,shou次在所著的《分析生物化學(xué)》(Analytical Biochemistry)中被叫做Western Blot。蛋白免疫印跡(Western Blot)是從凝膠往固相支持物NC膜或PVDF膜上轉(zhuǎn)移電泳分離后的細(xì)胞或組織總蛋白質(zhì),然后用特異性抗體來(lái)對(duì)某特定抗原檢測(cè)的一種蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù),現(xiàn)在在疾病早期診斷、抗體活性檢測(cè)以及基因在蛋白水平的表達(dá)研究方面得到了廣泛的應(yīng)用。
含量測(cè)定
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
(1)從-20℃將1mg/ml BSA取出,室溫融化后備用。
(2)將1.5ml離心管取18個(gè),3個(gè)一組,分別標(biāo)記為0μg,2.5μg,5.0μg,10.0μg,20.0μg,40.0μg。
(3)根據(jù)下面的表格將各種試劑加入到各管中。
(4)混勻后,室溫放置2分鐘,在生物分光光度計(jì)(Bio-Photometer,Eppentoff)上比色分析。
2、樣品蛋白含量的檢測(cè)
(1)取1.5ml離心管足夠多,將1ml4℃儲(chǔ)存的考馬斯亮藍(lán)溶液分別加入到每個(gè)離心管中,在室溫下放置30分鐘以后,就能夠被用來(lái)對(duì)蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
(2)將100ul 0.15mol/L NaCl溶液加入到取出的一管考馬斯亮藍(lán)溶液中,混勻放置2min中,就能夠作為空白樣品,在比色杯中倒入空白樣品,在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank對(duì)空白樣品進(jìn)行檢測(cè)。
(3 )將空白樣品棄掉,比色杯使用無(wú)水乙醇清洗2次(每次0.5mL),再將其使用無(wú)菌水洗一次。
(4)將95ul 0.15mol/L NaCl加入到取出的一管考馬斯亮藍(lán)溶液中,混勻后靜置2min,往扣干的比色杯中倒入按sample鍵對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。