在分子水平上，一個生物體的生理功能在很大程度上由它所表達(dá)的蛋白質(zhì)決定，并且在大多數(shù)疾病病例中，蛋白質(zhì)的功能失常往往是疾病的根本原因。

與傳統(tǒng)的故障排查和維修一樣，蛋白質(zhì)的功能失常要找到問題根源進(jìn)行修復(fù)，必須了解它是如何構(gòu)建的，以及維持其各個功能的組件。而冷凍電鏡技術(shù)（cryo-EM）正是可以幫助我們解讀蛋白質(zhì)等重要細(xì)胞機(jī)制的結(jié)構(gòu)生物學(xué)。

近期，國外媒體采訪了格羅寧根大學(xué)(University of Groningen) 結(jié)構(gòu)生物學(xué)系高分辨率cryo-EM負(fù)責(zé)人Cristina Paulino（助理教授），請其介紹了cryo-EM在其團(tuán)隊(duì)研究膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能方面所發(fā)揮的重要作用。

媒體：研究膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的機(jī)制及結(jié)構(gòu)的重要意義？您通常研究哪些特定類型的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白？為什么？

Cristina Paulino（CP）：獲得結(jié)構(gòu)性見解是解開蛋白質(zhì)作用機(jī)制的基礎(chǔ)。將蛋白質(zhì)功能和生理數(shù)據(jù)相結(jié)合時，我們能夠詳細(xì)了解這些蛋白質(zhì)如何運(yùn)作，了解它們?yōu)槭裁匆约叭绾伟l(fā)生故障，疾病的原因是什么以及我們?nèi)绾谓鉀Q它。我喜歡將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比作“組裝機(jī)器的藍(lán)圖”。雖然遺傳學(xué)和生物化學(xué)有助于理解蛋白質(zhì)的生理作用，但結(jié)構(gòu)生物學(xué)揭示了這些納米機(jī)器的外觀以及它們的連接方式。只有這樣，我們才能理性地理解它們并利用這些知識來修復(fù)、設(shè)計(jì)或阻止它們。例如，基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)等。

我的研究重點(diǎn)是闡明嵌入膜中的蛋白質(zhì)的作用機(jī)制，特別是膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和通道的作用機(jī)制。盡管膜蛋白具有高藥理學(xué)相關(guān)性（目前超過60％市售藥物的目標(biāo)膜蛋白），但對膜蛋白的結(jié)構(gòu)-功能-關(guān)系的研究還很少，需要生物學(xué)、化學(xué)和物理學(xué)等跨學(xué)科方法交叉研究。

雖然我的小組主要研究關(guān)于這些蛋白質(zhì)如何發(fā)揮作用的基本問題，但研究結(jié)果可以帶來額外的社會經(jīng)濟(jì)應(yīng)用。這在我們對人類ASCT2的研究中得到證實(shí)，人類ASCT2是人體細(xì)胞中谷氨酰胺攝取的主要來源，與癌細(xì)胞生長，患者生存率低以及癌癥治療的新熱靶點(diǎn)密切相關(guān)。除了解開其運(yùn)輸機(jī)制細(xì)節(jié)的工作外，我們還與藥物化學(xué)家合作，以確定新的抑制劑并指導(dǎo)基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)。其他研究模糊了傳統(tǒng)運(yùn)輸機(jī)制中存在的傳統(tǒng)概念邊界。例如，KdpFBAC復(fù)合物，即細(xì)菌中的緊急鉀攝取系統(tǒng)，結(jié)合了主要活性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和通道的特征。在TMEM16家族中，成員既可以作為鈣激活的氯離子通道，也可以作為脂質(zhì)打亂酶，甚至兩者兼而有之。我們的研究表明，在進(jìn)化過程中，保守蛋白結(jié)構(gòu)不僅相互進(jìn)化，而且可以融合在一起，以適應(yīng)不同的環(huán)境和細(xì)胞需求。

TMEM16家族的膜蛋白研究成果發(fā)表在2019年3月12日的eLife期刊上的兩篇背靠背論文中

媒體：cryo-EM對你工作的重要性如何？對團(tuán)隊(duì)能力提升有哪些影響？

CP：在過去幾年中，cryo-EM已被證明是結(jié)構(gòu)生物學(xué)中不可或缺的技術(shù)，提供了超過X射線晶體學(xué)的幾個優(yōu)點(diǎn)，即(i)只需要少量的蛋白質(zhì); （ii）不受蛋白質(zhì)晶體形成的限制;(iii)幾乎不受緩沖成分的限制，并允許在凍結(jié)前誘導(dǎo)構(gòu)象變化;(iv)不受樣本成分或構(gòu)象異質(zhì)性的影響，使我們得以一窺結(jié)構(gòu)動力學(xué); （v）能夠確定低分辨率和高分辨率結(jié)構(gòu);(vi)允許使用模擬天然脂質(zhì)環(huán)境的工具，如納米盤。值得注意的是，雖然冷凍電鏡獲得的分辨率平均低于x射線晶體學(xué)，但對于膜蛋白獲得的共同分辨率是相似的（約3-4埃）。事實(shí)證明，這些優(yōu)勢對于解決使用膜蛋白時面臨的幾個挑戰(zhàn)至關(guān)重要，可以進(jìn)行前所未有的研究，并使cryo-EM成為研究膜蛋白結(jié)構(gòu)的首選技術(shù)。因此，cryo-EM是我們小組采用的主要技術(shù)。

媒體：使用cryo-EM推斷一個膜蛋白結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)周期大概需要多久？

CP：在比較理想環(huán)境條件下，有一個比較理想的樣品，一個性能良好的高端顯微鏡，有一套強(qiáng)大的圖像處理集群，你可以在幾天內(nèi)解決一個高分辨率的結(jié)構(gòu)。然而，在現(xiàn)實(shí)實(shí)驗(yàn)中，特別是在處理具有挑戰(zhàn)性的膜蛋白時，時間周期通常是幾周或幾個月。

媒體:你最近用cryo-EM測定了TMEM16蛋白家族的結(jié)構(gòu)。在新聞稿中，您聲明這種方法“允許您對活動結(jié)構(gòu)動態(tài)進(jìn)行采樣”。能詳細(xì)談?wù)剢?為什么cryo-EM優(yōu)于其他可用的方法?

CP: cryo-EM的優(yōu)點(diǎn)之一是樣品經(jīng)過震蕩冷凍，保留了溶液中的所有構(gòu)象。這與x射線晶體學(xué)形成了強(qiáng)烈的對比，x射線晶體學(xué)的定義是，晶體中的所有蛋白質(zhì)都處于相同的狀態(tài)，而這種狀態(tài)通常局限于能量優(yōu)先構(gòu)象。此外，我們還可以在圖像處理的層面上處理cryo-EM圖像中存在的構(gòu)象異質(zhì)性。因此，我們可以從相同的樣品中確定蛋白質(zhì)在溶液中的幾種結(jié)構(gòu)，它們代表不同的功能狀態(tài)。在我們最近關(guān)于脂質(zhì)scramblase TMEM16的研究中，我們能夠在激活條件下獲得幾種超燃酶結(jié)構(gòu)。我們將這些不同的構(gòu)象解釋為該蛋白逐步激活機(jī)制的快照，并提出其中一種中間狀態(tài)可能與某些TMEM16蛋白中觀察到的非選擇性離子傳導(dǎo)有關(guān)。

媒體:在您的研究領(lǐng)域里使用cryo-EM有什么限制嗎?如何才能克服這些限制?

CP: cryo-EM在過去幾年里發(fā)展得如此之快和如此之多，我感到非常興奮。盡管該技術(shù)不斷地重新定義其局限性并變得更加用戶友好，但我們?nèi)匀幻媾R一些挑戰(zhàn)。然而，對于x射線晶體學(xué)來說，獲得完全可操作和維護(hù)的同步加速器束流線基本上是免費(fèi)的，而cryo-EM的總體成本和操作所需的專業(yè)水平一直是一個障礙。在一定程度上，政府對cryo-EM設(shè)備的補(bǔ)貼緩解了這一問題，但并沒有完全解決。

在我的小組中，我們有一個內(nèi)部的高端cryo-EM供我們使用，我們確保對所有小組成員進(jìn)行徹底的培訓(xùn)。其他障礙包括圖像處理集群的獲取和成本、數(shù)據(jù)管理(每天可以記錄幾個TB數(shù)據(jù))和圖像處理方面的專門知識。幸運(yùn)的是，它的成本隨著時間的推移而降低，而圖形處理單元驅(qū)動軟件的實(shí)現(xiàn)使成本保持在可承受范圍內(nèi)。當(dāng)然，樣品制備有很大的改進(jìn)空間(例如，需要更少量的蛋白質(zhì)并避免空氣 - 水界面)，幾個團(tuán)隊(duì)和公司正在致力于解決這個問題。

最后，解決一個結(jié)構(gòu)所需的總時間，以及尺寸和平均分辨率的限制，仍然對基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)所需的高通量方法構(gòu)成挑戰(zhàn)和阻礙。這些問題正在通過結(jié)合更穩(wěn)定的電子顯微鏡、更好和更有效的電子探測攝像機(jī)和改進(jìn)的處理算法得到解決。