日本分子細(xì)胞生物學(xué)家，東京工業(yè)大學(xué)榮譽教授大隅良典(Yoshinori Ohsumi)榮獲2016年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎，以表彰其在研究自噬性溶酶體方面作出的貢獻(xiàn)。

馬場美鈴老師作為本次獲獎?wù)n題研究的核心人物，深受業(yè)界人士的關(guān)注。她是如何掌握電子顯微鏡技術(shù)，最終研發(fā)出酵母獨特的快速冷凍置換固定法?

還有，她對電鏡觀察的執(zhí)著與熱情來源于什么?

為了找到這些問題的答案，我特地前往工學(xué)院大學(xué)八王子校園內(nèi)的實驗室，采訪了馬場美鈴博士。

捕捉自噬現(xiàn)象的決定性瞬間

——憑借卓越的電鏡技術(shù)，全球首次成功拍攝自噬圖

原文標(biāo)題：オートファジー現(xiàn)象の決定的瞬間を捉えて——卓越した電子顕微鏡技術(shù)が世界初の撮影を成功させる

采訪·文：山田一郎，大塚智惠

中文編輯：蔣雪 (91儀器信息網(wǎng)授權(quán)發(fā)布)

工學(xué)院大學(xué) 綜合研究所 研究員 馬場美鈴 博士

從一開始覺得有趣到不斷探索電子顯微鏡   

2016年，大隅良典(東京工業(yè)大學(xué)榮譽教授)因“在細(xì)胞自噬機制方面的發(fā)現(xiàn)”獲得諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎，馬場美鈴博士也為這一課題研究發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。之所以這么說，是因為馬場博士的電子顯微鏡技術(shù)是大隅教授能夠在自噬研究方面作出突破的基礎(chǔ)。

在日本女子大學(xué)上學(xué)時，馬場博士第一次接觸電子顯微鏡。她學(xué)的是家政學(xué)專業(yè) 家政理學(xué)系(理學(xué)部前身)，大二的時候輔修了大隅正子教授的電子顯微鏡課?！巴ㄟ^電子顯微鏡觀察動物細(xì)胞時，真的很意外，沒想到細(xì)胞里面這么漂亮，我很開心，也非常感動”。

此后，馬場博士開始孜孜不倦的閱讀小川和郎課題組編著的“電子顯微鏡圖說細(xì)胞學(xué)”(1974年發(fā)行)。這本書上有許多動物、昆蟲、微生物、細(xì)菌等的電子顯微鏡圖像，清晰呈現(xiàn)了肉眼看不到的微細(xì)結(jié)構(gòu)，向世人展示了微觀世界的美妙。

由于對電鏡的濃烈興趣，大三時，馬場博士到學(xué)校實驗室當(dāng)助手，幫忙制備植物細(xì)胞切片。“剛開始沒什么經(jīng)驗，很難切出一個超薄的切片。所以一般我會先切，然后用電鏡看看切的怎么樣。觀察自己第一次做的切片時，我看到了很多的刀痕，但是能夠看到植物細(xì)胞壁的內(nèi)部結(jié)構(gòu)我還是很興奮”，似乎也正是因為電鏡的魅力，才促使她“毅然決然地選擇了電子顯微鏡的研究”。日本女子大學(xué)校有電鏡實驗室，那時，馬場博士一邊做生物學(xué)的研究，一邊跑電鏡實驗室，開啟了電鏡研究的日常?！爱?dāng)時實驗室電鏡設(shè)備一應(yīng)俱全，所以可以說我是十分幸運的。除了透射電子顯微鏡(TEM)、掃描電子顯微鏡(SEM)外，還有冷凍復(fù)型電鏡、冷凍切片機。實驗室買了新設(shè)備，我都會學(xué)著用，慢慢學(xué)到的東西也越來越多?！?/p>

馬場博士卓越的操作技術(shù)，是她日積月累的成果。她鍥而不舍，反復(fù)練習(xí)，才真正掌握了切片、冷凍復(fù)型、冷凍切片等技術(shù)。而且她還經(jīng)常參加儀器培訓(xùn)。比如，在報名參加某個培訓(xùn)時，只有兩個人，一個就是馬場博士。一般的大會只是泛泛而談，但這種培訓(xùn)會講的十分詳細(xì)，鏡筒都會拆卸很多次。她熟讀本陣良平著作的“醫(yī)學(xué)生物學(xué)電子顯微鏡入門”(1968年發(fā)行)，以掌握電鏡理論。而且，電鏡實驗室的儀器出現(xiàn)故障時，她會緊跟在維修人員身后，觀察他們的操作，不時提出疑問，在實踐中不斷學(xué)習(xí)。她也經(jīng)常參加學(xué)術(shù)會議，與時俱進(jìn)，學(xué)習(xí)新技術(shù)。她思維敏捷，洞察力強，能快速抓住要點。在日積月累的學(xué)習(xí)中，掌握了卓越的電鏡技術(shù)。

成功開發(fā)快速冷凍法，可觀察酵母的超微結(jié)構(gòu)   

酵母獨特的快速冷凍置換固定法的研發(fā)成功，彰顯出馬場博士的電鏡技術(shù)實力。當(dāng)時，她一直在使用電鏡觀察真菌微生物--酵母，探究其微細(xì)結(jié)構(gòu)。實驗中發(fā)現(xiàn)：對于菌類細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)的觀察，最大的問題是固定組織標(biāo)本。觀察運動細(xì)胞中的細(xì)胞器等物質(zhì)時，必須要固定組織標(biāo)本才可以正常觀察?！笆写ɡ蠋熣n題組從10多年前就開始使用快速冷凍法對動物細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行固定，由此拍攝了很多電鏡圖像。但是，類似酵母這樣的真菌細(xì)胞會受到細(xì)胞壁干擾，即使采用Heuser型金屬接觸法(動物細(xì)胞處理方法)，觀察效果還是欠佳。而且如果不破壞細(xì)胞壁，固定液就無法進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，所以我覺得這個實驗可能注定要失敗了”

就在這個關(guān)鍵節(jié)點，以田中健治(當(dāng)時名古屋大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬醫(yī)真菌研究機構(gòu)教授)為代表的酵母細(xì)胞研究會，迫切需要一種快速冷凍方法。由于當(dāng)時Howard,R.J. 和Aist,J.R. 已成功研發(fā)出快速冷凍線狀真菌的方法，研究會鄭重邀請其中一人，在日本舉辦了研討會。田中教授和日本女子大學(xué)的研究員(小堀博美)參加了那場研討會，并收獲良多。但是，酵母和線性真菌的細(xì)胞壁性質(zhì)不同，更不好處理，實驗進(jìn)展不太順利。

“于是我嘗試將細(xì)胞壁切開，夾成“三明治”。把酵母細(xì)胞夾在兩個銅板之間，浸入冷卻保護(hù)劑中，使之快速冷凍，然后切割破壞細(xì)胞壁，將組織標(biāo)本浸入鋨酸(OsO4)溶液內(nèi)，如此反復(fù)多次。最終成功研發(fā)出冷凍復(fù)型方法。核糖體也有細(xì)胞壁，當(dāng)拍攝到細(xì)胞內(nèi)清晰的結(jié)構(gòu)時，我非常興奮。當(dāng)時也是別無他法，我才嘗試溶解細(xì)胞壁，破壞核糖體，提取細(xì)胞組織。當(dāng)然這些都寫進(jìn)論文里了”

1987年，酵母獨特的快速冷凍置換固定法別名“夾心法”誕生了。自此之后，電子顯微鏡可以觀察到酵母細(xì)胞的整體形貌，但這需要操作人員熟練掌握操作技巧。1990年前后，全世界僅有3個人能夠用這種方法成功觀察酵母細(xì)胞。其中一人，自不必說，當(dāng)然是經(jīng)過諸多波折研發(fā)出這種新方法的馬場博士本人。

自噬研究源于“想要觀察”   

馬場博士一直努力鉆研電子顯微鏡技術(shù)，逐漸她開始渴望更深入的研究。于是她辭去日本女子大學(xué)的工作，1988年進(jìn)入工學(xué)院大學(xué)，專注于科學(xué)研究。那之后她經(jīng)常到大隅良典的駒場實驗室做技術(shù)交流，當(dāng)時大隅良典剛升為東京大學(xué)教養(yǎng)學(xué)部的副教授。大隅教授曾將分離的液泡送至日本女子大學(xué)進(jìn)行冷凍復(fù)型處理，隨后不久，大隅教授和馬場博士二人便開始一起進(jìn)行科研項目研究?！叭辗e月累，我掌握的技術(shù)越來越多，于是我開始不滿足于現(xiàn)狀，就在這時聽說大隅教授建了駒場實驗室。剛開始，兩個人只是討論一起寫的論文。后來，我會用電子顯微鏡來驗證一些假想，隨著研究思路和方向日漸清晰，我覺得實驗過程也變得十分有趣，而且令人沉迷。所以，我連歌手荒井由美結(jié)婚了都不知道(笑)。我一心撲在研究上，不太關(guān)注其他事情”

大隅教授主要研究酵母菌液泡的物質(zhì)輸送。液泡可儲存細(xì)胞內(nèi)的有機代謝產(chǎn)物，它和溶酶體一樣均含有分解酶，所以推測液泡應(yīng)該具備分解作用。使用光學(xué)顯微鏡觀察饑餓狀態(tài)的酵母細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)液泡內(nèi)堆積著很多圓形顆粒。

“但是，光學(xué)顯微鏡的分辨率低，很難捕捉到顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)?！跋胍纯催@到底是什么”。因為大隅教授的這句話，開啟了自噬機制研究”。大隅教授與桂勛(現(xiàn)國立遺傳學(xué)研究所所長)成立了共建實驗室，實驗室有光學(xué)顯微鏡，走廊還放了一臺細(xì)胞培養(yǎng)裝置。據(jù)馬場博士回憶，如果拿“宇宙時代”比喻當(dāng)時日本女子大學(xué)的設(shè)備等級，那駒場實驗室就是“石器時代”?！按笥缃淌谝惶骄烤沟南敕ê軓娏摇Ｗ畛醮笥缃淌谕ㄟ^溶解酵母細(xì)胞壁，形成原生質(zhì)體，然后向細(xì)胞組織內(nèi)注入鋨酸，采用常用的固定法觀察了組織細(xì)胞。他當(dāng)時說道，“即使污染標(biāo)本也沒關(guān)系，想用電鏡觀察看看”。觀察時，液泡內(nèi)一片漆黑。所以只能通過快速冷凍處理組織切片。但是，駒場實驗室沒有固定時所用的細(xì)胞冷凍裝置。他拿著自己畫好的圖紙，讓本鄉(xiāng)的工廠照圖生產(chǎn)?！?/p>

世界首次成功拍攝自噬的電鏡圖   

工廠生產(chǎn)的小型細(xì)胞冷凍裝置雖然沒有溫控功能，但只要具備熟練的操作技巧和豐富的專業(yè)知識，就能成功冷凍細(xì)胞。但是，快速冷凍酵母細(xì)胞對于馬場博士來說也是一道難關(guān)。因為饑餓狀態(tài)的酵母細(xì)胞，細(xì)胞壁會變厚，液泡體積增大。“液泡和細(xì)胞質(zhì)不同，含水量多，宛如水中漂浮的顆粒。在低溫冰凍過程中液泡會迅速形成冰晶，難以切出結(jié)構(gòu)完整的組織切片，而且產(chǎn)生的冰晶會損傷細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)。很難做到細(xì)胞冷凍狀態(tài)剛剛好，我嘗試很多次都失敗了。而且，切割標(biāo)本時，刀需要正對標(biāo)本，制備超薄切片要步步嚴(yán)謹(jǐn)，整個標(biāo)本制備的過程必須全神貫注。”

歷經(jīng)諸多波折，馬場博士終于找到快速冷凍酵母細(xì)胞的方法。并于1989年拍攝到自噬現(xiàn)象的電鏡圖像，成為世界第一人?！芭牡降膱D片真的是太漂亮了。顆粒是圓形的。從這張圖上可以清晰地看到被細(xì)胞膜包圍的細(xì)胞質(zhì)。當(dāng)大隅教授看到(運動的顆粒正是)細(xì)胞質(zhì)時，他激動地說道‘用它可以寫兩篇論文了’”

事實上圖像拍攝也蘊含了很多技術(shù)含量，比如，冷卻速度需在1秒內(nèi)冷卻到10,000 C以下，當(dāng)然這些鮮為人知。想要獲取清晰圖像可不是那么輕松的。

馬場博士之所以能取得這一輝煌成就，是因為她在工學(xué)院大學(xué)夜以繼日地鉆研和努力。實驗中使用的儀器就是日立生產(chǎn)的高分辨電鏡H-500H。拍攝完圖像后還要寫總結(jié)報告，據(jù)悉她有時將近3個月都呆在實驗室里。日立生產(chǎn)的電子顯微鏡不單單對工學(xué)院大學(xué)，對其他高校的研究也發(fā)揮了重要的作用?！叭樟⒓瘓F旗下的日制產(chǎn)業(yè)(日立高新技術(shù)前身)在市谷建立了實驗室，我還借用過那里的H-7000或H-7100。很可惜現(xiàn)在不能租借了，而且最難得的是，以前用戶可以免費使用一整天。當(dāng)時拍攝的圖像作為抑制性細(xì)胞被刊載在獲獎?wù)撐闹小?/p>

她這樣總結(jié)電子顯微鏡對自噬研究作出的貢獻(xiàn)?！昂敛豢鋸埖恼f，細(xì)胞質(zhì)的發(fā)現(xiàn)開啟了自噬研究的大門。這是第一步。第二步，通過快速冷凍置換固定法觀察標(biāo)本，清晰觀察到膜動態(tài)，推動了酵母自噬體的研發(fā)進(jìn)程。反復(fù)實驗證實了液泡內(nèi)的機制。根據(jù)生物化學(xué)方法無法觀察到自噬體和液泡膜融合的過程，而通過電鏡可以清晰捕捉到自噬體進(jìn)入液泡的瞬間，這是電鏡獨有的特點。而且圖像極其清晰，其他實驗室做不到?！?/p>

自噬機制是指液泡與自噬體融合形成溶解酶，降解不需要的蛋白質(zhì)，重新生成生命活動所需的蛋白質(zhì)。兩年后大隅教授將這一發(fā)現(xiàn)寫入論文，但大隅實驗室對于自噬研究的腳步不曾停止。1996年馬場博士因“酵母自噬的形態(tài)學(xué)研究”，被授予博士(理學(xué))學(xué)位。

左：細(xì)胞在饑餓狀態(tài)下，自噬體(細(xì)胞質(zhì))進(jìn)入液泡內(nèi)

右：自噬體遭到破壞時，細(xì)胞吸收液泡內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)

挑戰(zhàn)尚未解開的無數(shù)自噬謎題   

2016年10月3日大隅良典教授榮獲諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。2015年就是日本人榮獲這一殊榮，所以馬場博士覺得“今年希望渺?！?，甚至她都忘了頒獎這么重要的日子。共同參與自噬項目研究的馬場則男，當(dāng)接到報社記者打來的電話時，十分意外，慌張地打開電視，看到大隅教授正在接受記者采訪。

“她發(fā)言時還提到我的名字。科研就是這樣的，身邊的人得獎，所以我做的相關(guān)研究也受到了關(guān)注，但是我當(dāng)時并沒有那么興奮，反而十分冷靜，感觸倒是很多。隨后，我接受了記者采訪。隨著時間的沉淀，我越發(fā)感覺到這個獎項的分量?！?/p>

自噬研究始于1988年，歷經(jīng)28年才得此殊榮。目前馬場博士正在和自噬期刊主編(國外科研學(xué)者)合作，共同研究自噬現(xiàn)象。

“有時我們可以捕捉到細(xì)胞變化的決定性瞬間。所以，研究人員要保持好奇心，善于發(fā)現(xiàn)，這非常重要。自噬體膜會被溶酶體釋放的各種酶破壞，因此很難被檢測到。當(dāng)然我們也曾苦惱于看不清膜結(jié)構(gòu)，究其原因也無人知曉。前方的路未知，腳踏實地大膽探索，才能走出一條成功路。我一直秉承著這種工作態(tài)度。

自噬實則是一種細(xì)胞自身成分降解和循環(huán)的基本過程，據(jù)說帕金森病等神經(jīng)退行性疾病就受自噬效應(yīng)影響。因此這一發(fā)現(xiàn)對于未來醫(yī)療發(fā)展具有深遠(yuǎn)的意義。引一句大隅教授的話，“目前我們對自噬現(xiàn)象的了解只有30%?！瘪R場博士也提到：“自噬體膜的起源尚未可知，而且目前我們對于變異株的了解也只是皮毛，所以未來的路任重道遠(yuǎn)”。為揭開基礎(chǔ)領(lǐng)域的面紗，馬場博士利用電子顯微鏡專心研究自噬形態(tài)學(xué)，日復(fù)一日年復(fù)一年，從未放棄。

    編者按   

馬場博士直言相告道，“前方的路未知，腳踏實地大膽探索，才能走出一條成功路”，想必這句話能引起不少讀者的共鳴吧。不論是什么行業(yè)，那些勇于探索未知的人大抵都懷著同樣的氣魄，不斷嘗試開辟一條新路。由于史無前例，毫無借鑒經(jīng)驗參考，所以經(jīng)常會碰壁，盡管如此他們還是一往無前。這份動力大概源于“熱愛”吧。

在舊刊號INTERVIEW Vol.6的影像結(jié)尾小泉秀明如是說道。馬場博士用事實向我們證明了“只要你滿懷熱愛，就算周圍人反對也一定會堅持到底，以及一個優(yōu)秀的團隊是創(chuàng)新的重要基石”。SI NEWS特輯也迎來了“INTERVIEW”系列第7版。我十分敬佩老師們志存高遠(yuǎn)和堅持不懈的努力精神，每每看到這些，我都備受鼓舞，充滿干勁。SI NEWS今后將繼續(xù)努力為您傳播正能量。由于某些原因本期分兩次采訪。