鳥取大學(xué)醫(yī)學(xué)部解剖學(xué)講座講師稻賀SUMIRE，憑借低真空掃描電子顯微鏡(低真空SEM)，研發(fā)出了腎穿刺病理組織分析法。稻賀SUMIRE教授和腎臟病理學(xué)·腎臟病理診斷專家兼東京腎臟研究所所長-山中宣昭教授、鳥取大學(xué)醫(yī)學(xué)部圍產(chǎn)期·小兒醫(yī)學(xué)領(lǐng)域教授-岡田晉一齊聚日立高新技術(shù)公司東京解決方案實(shí)驗(yàn)室，暢談了以不同于傳統(tǒng)透射電鏡分析方法的低真空掃描電鏡，對光鏡樣品切片進(jìn)行三維分析的研發(fā)初衷，并對未來的電鏡發(fā)展作出了展望。

借助低真空SEM，探索三維世界

——腎穿刺標(biāo)本的新發(fā)現(xiàn)

原文標(biāo)題：低真空SEMで見る3Dの世界とその可能性——腎生検標(biāo)本への新たなアプローチ

中文編輯：蔣雪 (91儀器信息網(wǎng)授權(quán)發(fā)布)

鳥取大學(xué)醫(yī)學(xué)部解剖學(xué)講座 講師 稻賀 SUMIRE(左)

東京腎臟研究所 所長、日本醫(yī)科大學(xué) 名譽(yù)教授 山中 宣昭(中)

鳥取大學(xué)醫(yī)學(xué)部圍產(chǎn)期·小兒醫(yī)學(xué)領(lǐng)域 教授 岡田 晉一(右)

通過低真空SEM檢測分析腎穿刺標(biāo)本

由于腎病早期很難顯現(xiàn)主觀癥狀，且腎病種類繁多，難于判別，因此被稱為“難確診”的疾病。而且腎臟的結(jié)構(gòu)和功能極其復(fù)雜，所以腎穿刺的臨床應(yīng)用對于病情階段和病變形態(tài)的診斷有著深遠(yuǎn)的意義。1951年首次臨床應(yīng)用腎活體檢法。首先使用穿刺針取部分腎臟組織，通過光學(xué)顯微鏡觀察組織切片。然后采用熒光抗體法根據(jù)免疫球蛋白、補(bǔ)體的種類和沉淀情況等，判斷免疫反應(yīng)，再通過電子顯微鏡進(jìn)一步分析標(biāo)本，最后將光學(xué)顯微鏡、熒光抗體法和電子顯微鏡三者分析的結(jié)果結(jié)合起來，判斷病情、提出治療方案并估計(jì)預(yù)后等。腎穿刺活檢術(shù)作為日常檢查，這在醫(yī)療中具有特殊的臨床意義。

電子顯微鏡分析為腎活檢提供了許多新的數(shù)據(jù)。一般大家都用透射電子顯微鏡觀察標(biāo)本，樣品制備、圖像分析需要實(shí)驗(yàn)人員具備豐富的知識和技巧，因此往往診斷結(jié)果需要幾周的時(shí)間。

“可能你會想問，這樣的速度符合臨床醫(yī)生的要求嗎?”，稻賀SUMIRE教授如是說道。所以，為了簡單且快速診斷出病情，她利用低真空SEM研發(fā)出了腎穿刺病理組織分析法。稻賀教授退休前就職于鳥取大學(xué)醫(yī)學(xué)部，從事解剖學(xué)課題研究工作，退休后，開始從事低真空的研究。她的科研方向深得SEM界權(quán)威人士田中敬一教授的認(rèn)可。低真空SEM的分辨率雖遠(yuǎn)不及TEM，但它可以觀察油性、含水樣品和非導(dǎo)電性樣品。而且，操作簡單，待測樣品無需特殊處理。

腎穿刺標(biāo)本的TEM圖像

左：Alport綜合癥、右：薄基底膜腎病

為對比圖像的差異性，特為您展示這兩種腎病的TEM圖像。

使用Platinum-blue分染病理組織

稻賀教授充分發(fā)揮低真空SEM的優(yōu)勢。腎穿刺的應(yīng)用源于染色劑的出現(xiàn)?！拔艺J(rèn)為Platinum-blue染色劑將成為未來發(fā)展的關(guān)鍵?！碑?dāng)時(shí)電子染色劑乙酸鈾酰較為普遍，但隨著國家對于乙酸鈾酰的限制越來越嚴(yán)格，人們開始尋找替代品，于是Platinum-blue逐漸被業(yè)界人士關(guān)注。但是，市售的Platinum-blue染色劑對使用人群有所限制。為了解決這一問題，田中教授研發(fā)了Platinum-blue作為低真空SEM信號增強(qiáng)劑，稻賀教授巧妙設(shè)計(jì)了輔助操作的小配件，還因此榮獲了國家專利。這兩款產(chǎn)品和TEM染色劑同時(shí)投放市場，開始逐步普及。老鼠舌頭上有多種組織，故本次實(shí)驗(yàn)取老鼠舌頭局部用于制備樣品切片。后經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Platinum-blue染色劑可清晰分染幾種病理組織，這一發(fā)現(xiàn)我們也曾在學(xué)會上做過相關(guān)報(bào)告。

由于SEM觀察都是以TEM診斷法為依據(jù)進(jìn)行判斷的，所以日立高新技術(shù)TEM負(fù)責(zé)人向她建議道：“老師，那肯定就是腎臟了?！边@種方法一眼就能判斷出是病理組織。目前，稻賀教授還在探索更有價(jià)值的應(yīng)用方法?！爱?dāng)時(shí)，鳥取大學(xué)病理系老師為我們提供了很多種典型病理的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，通過使用Platinum-blue成功分染各個(gè)組織。”

通過電子顯微鏡分析樣品切片

稻賀教授和腎臟病理診斷第一人山中宣昭教授二人深刻感受到新方法論的重要性，并就此展開了激烈的討論。

“將標(biāo)本置于載玻片上，然后放入樣品倉內(nèi)，由于低真空特性我們可以清晰觀察到標(biāo)本。我認(rèn)為低真空SEM的應(yīng)用是電鏡歷史上的偉大創(chuàng)舉。如今，任何人均可通過電子顯微鏡觀察常見標(biāo)本、光學(xué)顯微鏡標(biāo)本等?！?/p>

PAM染色是一種光學(xué)顯微鏡樣品染色法，采用銀染法使組織切片著色，將這種方法和Platinum-blue染色法有機(jī)地結(jié)合起來，可進(jìn)一步提升分析的準(zhǔn)確性。

稻賀教授談到，“PAM染色法可分染基底膜，使組織結(jié)構(gòu)清晰，這種染色方式和Platinum-blue截然相反，所以我們聯(lián)用這兩種染色法，優(yōu)勢互補(bǔ)，染色結(jié)果極佳”?！岸襊AM染色具有悠久的歷史，經(jīng)山中教授課題組的矢島老師改良，操作現(xiàn)在變得十分簡單。PAM染色和Platinum-blue染色的有機(jī)結(jié)合，對當(dāng)今時(shí)代的腎病診斷具有重要的意義。從同一組織內(nèi)取兩個(gè)標(biāo)本，可通過PAM染色法和Platinum-blue染色法，全面觀察組織結(jié)構(gòu)，對病理進(jìn)行深入診斷?！?/p>

鳥取大學(xué)醫(yī)學(xué)部的岡田晉一教授和稻賀教授共同參與了腎病理組織分析法的研究。岡田教授從臨床醫(yī)學(xué)的角度出發(fā)，闡述了低真空SEM的未來應(yīng)用空間。

“低真空SEM的放大倍率高，如同光學(xué)顯微鏡一般，可以觀察到腎穿刺組織的每一個(gè)部位，我覺得這是它最大的優(yōu)勢。腎病是在腎臟多處發(fā)生相似病變，其中焦腎小球硬化(FSGS)是從局部開始病變，最終導(dǎo)致腎功能衰竭。因此，如果你沒有觀察到病變部位，就無法判斷是否異常。TEM只能觀察到組織的一小部分，如果這部分沒有異常，診斷結(jié)果就顯示正常。但這并不代表整個(gè)腎臟均無病變。低真空SEM觀察范圍廣，這對于局部病變的腎病診斷具有十分重要的意義。

在FSGS病理切片中觀察到腎小球的LV-SEM像

左(表面)：Platinum-blue染色、右(截面)：PAM染色

低真空SEM開啟了3D世界

隨著低真空SEM的應(yīng)用，分析一個(gè)標(biāo)本就可以獲取很全面的信息，分析準(zhǔn)確度也得到了進(jìn)一步提升。而且還可以對大視野范圍進(jìn)行高分辨、高倍率的形態(tài)觀察以及三維解析。

稻賀教授指出“低真空SEM和傳統(tǒng)TEM、光學(xué)顯微鏡最大的區(qū)別是：它可以實(shí)現(xiàn)立體觀察和三維成像?！薄癆lport綜合癥是在基底膜形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，之前我們一直采用TEM觀察切片的二維圖像來判斷是否發(fā)生病變，如籃狀細(xì)胞的觀察，現(xiàn)在我們可以使用低真空SEM觀察它真實(shí)的三維結(jié)構(gòu)?！?br>

Alport綜合癥為遺傳性疾病，其主要特征是腎小球基底膜發(fā)生病變。薄基底膜腎病也是由于腎小球基底膜發(fā)生病變引起的，Alport綜合癥患者往往在青壯年時(shí)期發(fā)展至終末期腎臟病，必須通過透析進(jìn)行治療。這兩種腎病的鑒定對于患者的治療和預(yù)后等具有十分重要的意義。岡田教授提到，“過去我們利用免疫染色或透射電子顯微鏡進(jìn)行腎病鑒定，現(xiàn)如今診斷技術(shù)已實(shí)現(xiàn)遺傳基因檢測，盡管如此，還是不能診斷出腎病類型，而低真空SEM可全面獲取標(biāo)本數(shù)據(jù)，快速且準(zhǔn)確診斷腎病”。

圖示為Alport綜合癥患者的腎小球在低真空SEM下的圖像(PAM染色)。

低真空SEM下清晰呈現(xiàn)基底膜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

山中教授也提及到三維數(shù)據(jù)的重要性。

“光學(xué)顯微鏡一般可以觀察3微米，最厚5微米的樣品，而低真空SEM在這個(gè)厚度可以實(shí)現(xiàn) 三維觀察，這樣一來可以獲取更多的數(shù)據(jù)信息。我們生活在三維空間，二維角度觀察標(biāo)本確實(shí)是維度較低。從這個(gè)層面來考慮，對同一樣品進(jìn)行三維觀察時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)許多二維圖像無法判斷出來的病癥?！?

開啟一個(gè)嶄新的階段

山中教授將低真空SEM應(yīng)用到細(xì)胞診斷學(xué)中，以檢查腫瘤組織以及胸腔積液和腹水等液體中的癌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)取得了突破性進(jìn)展。為了實(shí)現(xiàn)低真空SEM在腎穿刺手術(shù)及腎病理研究中真正的價(jià)值，并且未來還能夠應(yīng)用于腎臟以外的病變組織檢查或快速診斷，我們需要確保標(biāo)本質(zhì)量，完善基本診斷標(biāo)準(zhǔn)。而且，在分析圖像時(shí)，還需要具備解讀標(biāo)本病理的診斷能力。

“低真空SEM成像很簡單，而觀察和分析圖像才是最難的?！睂锝淌谘缘?，“我第一次使用低真空SEM，實(shí)在難以辨認(rèn)切片結(jié)構(gòu)，還好有稻賀教授在，她逐一為我解釋，這是細(xì)胞，這是基底膜之類的。低真空SEM的觀察方式和光學(xué)顯微鏡、熒光抗體法不同，初次使用簡直是一頭霧水。因此，我覺得可以建立公共數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫內(nèi)存有IgA腎病的病變組織、上皮細(xì)胞等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，這樣便于用戶參照分析?！?/p>

為加深對于低真空SEM病理組織分析法和其優(yōu)勢的理解，山中教授強(qiáng)調(diào)了病例數(shù)據(jù)庫的重要性。

“不同腎病其腎臟組織形態(tài)學(xué)的病變不一樣，所以盡管通?？捎^察到的腎臟組織形態(tài)學(xué)變化較小，但這種變化卻僅存在于極少數(shù)病例中，所以大致也可以斷定腎病類型。我們可以收集很多Alport綜合癥和薄基底膜腎病的病例，建立公共數(shù)據(jù)庫，更快、更準(zhǔn)地診斷病理。所以數(shù)據(jù)庫的普及也十分重要?！钡举R教授也談到，解讀低真空SEM圖像本身并沒有那么難。她還在培訓(xùn)會上使用DEMO機(jī)為大家演示操作，據(jù)說只要掌握要點(diǎn)，完全可以輕松解讀低真空SEM圖像。一個(gè)出色的方法論的應(yīng)用關(guān)乎未來的發(fā)展趨勢。據(jù)說方法論的開發(fā)已歷經(jīng)10年之久。

“對于一個(gè)病理的小白來說，即使去研究腎病的診斷方法，也是毫無頭緒。山中教授向大家介紹了如何診斷腎病，由于他的耐心指導(dǎo)，感興趣的人越來越多，我覺得這才是真正意義上的新開始。未來，數(shù)據(jù)庫將不斷壯大，診斷標(biāo)準(zhǔn)、診斷方法和Atlas等也將不斷完善。”