繼全自動(dòng)毛細(xì)管Western Blot助力Merck公司全球首個(gè)預(yù)防埃博拉病毒病的商品化疫苗ERVEBO?上市后，近日，Merck公司疫苗分析研究進(jìn)展與疫苗工藝開發(fā)部門再發(fā)文章：利用還原全自動(dòng)毛細(xì)管Western Blot技術(shù)，定量人巨細(xì)胞病毒疫苗多種抗原水平，同時(shí)利用非還原的方法表征抗原蛋白額外二硫鍵和MW信息（多聚體抗原水平）。同時(shí)Merck公司還利用此方法確定了一些HCMV病毒中以前未知的生化特征：非還原條件中，病毒表面蛋白的三重gH峰，這可能會(huì)為HCMV病毒抗原的特異性測(cè)試提供一種新的策略。

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人類巨細(xì)胞病毒

人類巨細(xì)胞病毒(Human Cytomegalovirus, HCMV)，屬于β皰疹病毒亞科。根據(jù)地域的不同，世界上50%到90%的成年人口曾感染過(guò)HCMV。盡管感染HCMV很少會(huì)在健康成人中引起癥狀，但它卻是引起移植受者器官衰竭的主要原因。同時(shí)感染HCMV會(huì)對(duì)人類整個(gè)生命周期的健康造成威脅：對(duì)先天性感染的兒童造成神經(jīng)系統(tǒng)異常；對(duì)免疫抑制患者（移植病患或者免疫缺陷疾病AIDS患者）出現(xiàn)較高的發(fā)病率和死亡率；同時(shí)還會(huì)增加老年人死亡率、心血管疾病和癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。

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人類巨細(xì)胞病毒結(jié)構(gòu)

HCMV具有一個(gè)二十面體衣殼，其中包含雙鏈DNA，編碼165種蛋白質(zhì)。衣殼被蛋白質(zhì)包膜包圍，外部被一個(gè)脂質(zhì)包膜包圍，其糖蛋白通過(guò)與細(xì)胞膜融合進(jìn)入宿主細(xì)胞。融合后，DNA和被膜蛋白被釋放到細(xì)胞中。該病毒包含不同類型的糖蛋白復(fù)合物(glycoprotein complexes, gC)，用于感染宿主細(xì)胞：gC-I是由糖蛋白B(glycoprotein B, gB)的同源三聚體組成的復(fù)合物，糖蛋白B(gB)是一種泛皰疹病毒科保守的糖蛋白，介導(dǎo)膜融合過(guò)程：即介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞期間從融合前的構(gòu)象重新排列為融合后的構(gòu)象；gC-II是含量最豐富的gC，由糖蛋白M（glycoprotein M, gM）和N（glycoprotein N, gN）組成，有助于與細(xì)胞膜的初始結(jié)合，并在病毒復(fù)制中起作用；gC-III，現(xiàn)在稱為三聚體復(fù)合物(Trimer complex, TC)，是一種異源三聚體復(fù)合物，其中糖蛋白H(glycoprotein H, gH)、L(glycoprotein L, gL)和O(glycoprotein O, gO)連接在一起，gH和gL參與激活gB的融合活性，gO作為共同受體。還有一種五聚體復(fù)合物（Pentameric complex, PC）由gH/gL與UL128、UL130和UL131蛋白（pUL128–pUL131）組成，主要感染上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，有研究發(fā)現(xiàn)這種五聚體復(fù)合物（PC）對(duì)于引發(fā)保護(hù)性體液免疫反應(yīng)很重要，在自然感染中占>85%的中和活性。

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全球HCMV疫苗臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)展

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全自動(dòng)毛細(xì)管Western Blot定量HCMV減毒活疫苗抗原

全自動(dòng)毛細(xì)管Western Blot：基于毛細(xì)管電泳的免疫學(xué)檢測(cè)方法，只需3μL樣本，一次性加好樣本和反應(yīng)試劑（blocking液、一抗、二抗、顯色液、洗液），開始上機(jī)實(shí)驗(yàn)，儀器自動(dòng)上膠、加樣、跑膠、紫外交聯(lián)蛋白、一抗二抗孵育、顯色定量，CCD相機(jī)直接獲取化學(xué)信號(hào)，不出3小時(shí)直接獲得24個(gè)樣本定量結(jié)果。此過(guò)程除手動(dòng)加樣后，無(wú)需任何手動(dòng)操作，數(shù)據(jù)穩(wěn)定重現(xiàn)性佳（Merck結(jié)果CV<10%：見文章：全自動(dòng)毛細(xì)管Western Blot助力全球首款埃博拉疫苗ERVEBO?上市）。

Merck公司正在進(jìn)行的減毒活病毒HCMV疫苗（V160）的II期臨床試驗(yàn)中，在減毒活A(yù)D169病毒株表面恢復(fù)了五聚體復(fù)合物。因此重建的HCMV病毒含有多種表面糖蛋白：五聚體gH/gL/gUL128-131復(fù)合物、三聚體gH/gL/gO復(fù)合物、gB糖蛋白和gM/gN異二聚體復(fù)合物。因此Merck公司利用全自動(dòng)毛細(xì)管Western Blot定量的方法，監(jiān)測(cè)在疫苗開發(fā)過(guò)程中的多種病毒表面抗原。

還原毛細(xì)管Western Blot法鑒定9種抗原蛋白

在無(wú)(-)和有(+)PNG-F酶處理的情況下，還原毛細(xì)管Western Blot法鑒定HCMV中的9種糖蛋白：gH、gL、UL128、UL130、UL131、gO、gB、gM和gN。

原始峰形圖（PNG-F酶處理前為藍(lán)色峰，PNG-F酶處理后綠色峰）顯示，PNG-F處理后的MW shift 取決于每個(gè)糖蛋白上有多少N-連接的聚糖位點(diǎn)。N-連接的聚糖位點(diǎn)越多，偏移越大。例如有18個(gè)N-連接的聚糖位點(diǎn)的gO（偏移很大）和不含N-聚糖位點(diǎn)UL128（兩峰趨近一致）。

非還原毛細(xì)管Western Blot法鑒定不同聚體復(fù)合物

毛細(xì)管Western Blot可以提供特定病毒抗原的額外二硫鍵和MW信息。例如用非還原毛細(xì)管Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，用抗gH抗體觀察到~90kDa、~120kDa和~205kDa的三重峰。當(dāng)使用抗gL抗體時(shí)，僅觀察到120kDa和205kDa處的兩個(gè)峰。當(dāng)用抗UL128和抗gO抗體探測(cè)時(shí)，分別檢測(cè)到120 kDa和205kDa處的峰。這些數(shù)據(jù)明確表明，120kDa處的峰分配是由于gH-gL-UL128復(fù)合物，它是五聚體復(fù)合物(gH-gL-UL128-UL130-UL131)的一部分，其中UL130和UL131是非共價(jià)結(jié)合的。在205kDa處觀察到的峰被確認(rèn)為gH-gL-gO三聚體復(fù)合物。

在原始峰形圖上觀察到的三聯(lián)體的gH峰，并不是HCMV疫苗病毒(V160)獨(dú)有的，因?yàn)閮蓚€(gè)臨床分離株的HCMV也顯示了三聯(lián)體的gH峰。因?yàn)锳D169病毒株沒(méi)有五聚體復(fù)合物(gH-gL-UL128-UL130-UL131)，所以不顯示~120kDa的峰。同時(shí)結(jié)果也表明V160中g(shù)H單體(~90 kDa)和gH-gL-gO三聚體復(fù)合物(~205 kDa)的相對(duì)ratio與親本病毒AD169相當(dāng)。

用抗gM和gN抗體檢測(cè)到，在~138kDa 和236kDa處具有相同的兩個(gè)峰：138kDa峰可能是實(shí)際的gM/gN復(fù)合物，而236kDa為二聚體(gM/gN)2。

毛細(xì)管Western Blot監(jiān)測(cè)疫苗發(fā)酵工藝

利用特異性的三重gH峰面積可用于評(píng)估發(fā)酵過(guò)程中對(duì)五聚gH復(fù)合物的潛在影響。對(duì)九個(gè)開發(fā)批次的V160中，對(duì)五聚體gH復(fù)合物百分比進(jìn)行了比較。第1至第4批是在工藝優(yōu)化之前生產(chǎn)的，與工藝優(yōu)化后生產(chǎn)的第5至第9批相比，其gH-gL-UL128（五聚體復(fù)合物）含量較低。

同時(shí)毛細(xì)管Western Blot結(jié)果表明，五聚體的產(chǎn)量在感染后11-13天開始趨于穩(wěn)定。此外與生物反應(yīng)器3和4相比，生物反應(yīng)器1和2提供了更好的五聚體表達(dá)。這一觀察結(jié)果與微流式細(xì)胞儀測(cè)量的病毒顆粒濃度相吻合。

毛細(xì)管Western Blot絕對(duì)定量五聚體抗原

毛細(xì)管Western Blot絕對(duì)定量法的線性、R2、精密度、準(zhǔn)確度如圖所示，揭示了毛細(xì)管Western Blot絕對(duì)定量法可以用于定量HCMV的糖蛋白。

用重組五聚體蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，利用毛細(xì)管Western Blot絕對(duì)定量法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖A-C），用此方法定量疫苗樣本中的五聚體抗原（圖D）。

與Elisa法定量疫苗樣本中的五聚體抗原相關(guān)性R2=0.9941.

結(jié)論：

利用毛細(xì)管Western Blot方法檢測(cè)抗原蛋白，不需要純化樣品，因此該方法適用于分析多種樣品類型中的目標(biāo)蛋白，例如來(lái)自感染細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液、純化中間體、濃縮液和最終疫苗產(chǎn)品。同時(shí)此方法不只可以定量抗原蛋白，還可以利用非還原的方法表征抗原蛋白額外二硫鍵和MW信息。在此方法中還確定了一些HCMV病毒中以前未知的生化特征：非還原條件中，病毒表面蛋白的三重gH峰，這可能會(huì)為HCMV病毒抗原的特異性測(cè)試提供一種新的策略。

參考文獻(xiàn)：

1. Characterization of gH/gL/pUL128-131 pentameric complex, gH/gL/gO trimeric complex, gB and gM/gN glycoproteins in a human cytomegalovirus using automated capillary western blots, Vaccine. 2021 Jul 3.

2. Cytomegalovirus as an immunomodulator across the lifespan, Curr Opin Virol. 2020 Oct.

3. Development of a Vaccine against Human Cytomegalovirus: Advances, Barriers, and Implications for the Clinical Practice, Vaccines (Basel). 2021 May 25.