單個(gè)外泌體表征分析是將免疫學(xué)與光學(xué)完美結(jié)合的一種新技術(shù)[1]。該技術(shù)首先利用免疫識(shí)別將特定的外泌體進(jìn)行捕獲分離，然后再對(duì)目標(biāo)外泌體的表面標(biāo)志物及內(nèi)容物（如攜帶的蛋白質(zhì)、RNA、DNA及細(xì)胞因子）進(jìn)行定量分析，從而更加全面地反映外泌體的特性。作為外泌體表征分析的倡導(dǎo)者，美國(guó)NanoView Biosciences于2018年推出了全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)ExoView，該系統(tǒng)一經(jīng)推出，便引起了外泌體領(lǐng)域科研工作者的廣泛關(guān)注，僅兩年在全球已有50多個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用該技術(shù)，發(fā)表文獻(xiàn)近百篇。進(jìn)入2021年，使用ExoView發(fā)表的論文出現(xiàn)井噴性增長(zhǎng)，短短數(shù)月已經(jīng)發(fā)表了近30篇。本文將選取其中幾篇比較有代表性的文章，來(lái)說(shuō)明ExoView在腎臟再生、胎兒早產(chǎn)、miRNA等研究領(lǐng)域的具體應(yīng)用。

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ACS Nano：多聚脫氧核糖核苷酸和干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外囊泡的復(fù)合生物活性支架可用于腎臟再生

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慢性腎?。–KD）已是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，因?yàn)槠渲委煶杀靖撸野l(fā)病率和患病率在不斷增加。目前CKD的治療方法是腎臟替代療法，包括腹膜透析、血液透析和腎臟移植，但可用腎臟的數(shù)量無(wú)法滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的需求。因此，腎臟組織工程和腎臟再生被認(rèn)為是一種有前景的治療方法?；诖耍琄young-Won Ko等[2]研發(fā)了一種多孔氣動(dòng)微擠壓復(fù)合支架（PME），它是由聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA, P）、氫氧化鎂（MH, M）和脫細(xì)胞豬腎細(xì)胞外基質(zhì) (kECM, E) 組成，并用多聚脫氧核糖核苷酸（PDRN）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）/干擾素-γ（IFN-γ）誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外囊泡（TI-EV）進(jìn)行功能化，以促進(jìn)腎組織的再生和維持其功能。結(jié)果顯示與現(xiàn)有的腎部分切除小鼠模型的 PME 支架相比，PME/PDRN/TI-EV支架可誘導(dǎo)有效的腎小球再生和腎功能恢復(fù)。

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其中，研究人員使用ExoView對(duì)未處理的臍帶組織間質(zhì)干細(xì)胞的外泌體（UC-EV）和經(jīng)過(guò)TNF-α/IFN-γ 預(yù)處理的臍帶組織間質(zhì)干細(xì)胞的外泌體（TI-EV）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示CD9和CD81在UC-EV上顯著表達(dá)，而CD63主要在TI-EV 上表達(dá)（圖1）。由于CD63對(duì)內(nèi)吞作用很重要，因此TI-EV比UC-EV更容易被細(xì)胞攝取。

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圖1 ? ExoView檢測(cè)CD9、CD63、CD8在UC-EV和TI-EV中的表達(dá)

Lab on a Chip：細(xì)胞外囊泡介導(dǎo)的母胎之間HMGB1信號(hào)誘導(dǎo)早產(chǎn)

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早產(chǎn)（PTB，小于37周的妊娠）每年影響了全球約11％的孕婦，造成100萬(wàn)新生兒的死亡。高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是一種警報(bào)素，是衰老羊膜細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞外囊泡釋放的炎癥信號(hào)之一。羊水、臍帶血和孕婦血液中的HMGB1水平升高與足月和早產(chǎn)有關(guān)。Enkhtuya Radnaa等[3]通過(guò)電穿孔把正常羊膜上皮細(xì)胞的外泌體改造為含有HMGB1的外泌體（eHMGB1）并對(duì)其進(jìn)行表征，然后使用包含四個(gè)不同細(xì)胞類(lèi)型（羊膜、絨毛膜間充質(zhì)、絨毛膜滋養(yǎng)層和蛻膜細(xì)胞）的四腔微流控芯片器官設(shè)備（FMi-OOC）測(cè)試其在母-胎界面（FMi）中的傳播力。結(jié)果顯示導(dǎo)致PTB的eHMGB1與增加的FMi炎癥有關(guān)。該研究證明了胎兒外泌體介導(dǎo)的旁分泌信號(hào)傳導(dǎo)可以產(chǎn)生炎癥并誘導(dǎo)分娩。

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值得注意的是，研究人員對(duì)eCTRL與eHMGB1進(jìn)行熒光染色標(biāo)記并使用ExoView進(jìn)行檢測(cè)?；贓xoView可有效檢測(cè)外泌體內(nèi)容物的特性，研究結(jié)果顯示eHMGB1的HMGB1陽(yáng)性外泌體數(shù)量明顯高于eCTRL，而CD9和 CD63陽(yáng)性的外泌體在兩個(gè)樣本中數(shù)量接近，這表明HMGB1已成功裝載到eHMGB1中（圖2）。

圖2 ? ExoView檢測(cè)改造的對(duì)照外泌體（eCTRL）與eHMGB1

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Brain Behavior and Immunity：脊髓損傷導(dǎo)致血清神經(jīng)炎癥相關(guān)納米顆粒中miRNA與CD81+外泌體水平的改變

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脊髓損傷（SCI）會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生系統(tǒng)性影響，導(dǎo)致呼吸、免疫、消化等功能異常，以及相關(guān)腦區(qū)產(chǎn)生神經(jīng)炎癥和退行性病變。有研究表明，SCI的病理發(fā)展可能與血液中外泌體的運(yùn)輸有關(guān)；而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷模型中，外泌體可能參與了miRNA等炎性因子運(yùn)輸導(dǎo)致炎癥擴(kuò)散。Khan等[4]使用包括Exoview外泌體表型分析的多種技術(shù)詳細(xì)表征了SCI建模的小鼠血漿外泌體，發(fā)現(xiàn)損傷后外泌體的數(shù)量、蛋白marker和內(nèi)容物均有明顯的變化，將SCI小鼠的外泌體注射入腦室還可誘發(fā)產(chǎn)生炎癥。

研究人員使用ExoView檢測(cè)了SCI血漿外泌體的粒徑、數(shù)量、熒光強(qiáng)度和共定位（圖3A）。外泌體在CD81和CD9區(qū)域產(chǎn)生特異性結(jié)合而被捕獲，而沒(méi)有CD63捕獲。根據(jù)干涉成像獲得外泌體尺寸分布，其中在50nm最多（圖3B&C）。熒光成像則檢測(cè)到了大量干涉成像檢測(cè)不出的尺寸小于50nm的外泌體（圖3D&E），CD81和CD9在大量外泌體上表型出熒光共定位，而CD63熒光則未被檢測(cè)到，這與圖3C結(jié)果一致（圖3F-H）。

圖3 ? ExoView檢測(cè)血漿外泌體的粒徑、數(shù)量、熒光強(qiáng)度和共定位

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研究人員進(jìn)一步比較了SCI組和對(duì)照組的血漿外泌體變化，結(jié)果表明，在損傷后1d的時(shí)間點(diǎn)，CD81外泌體數(shù)量相對(duì)對(duì)照組更高，與Western Blot的結(jié)果一致；而CD9外泌體數(shù)量則沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與流式分析的結(jié)果一致（圖4A&B）。基于圖3H的CD81與CD9有大量的熒光共定位，檢測(cè)CD9外泌體的CD81熒光強(qiáng)度，由1d的熒光強(qiáng)度中位數(shù)差異可知，CD81+外泌體數(shù)量與外泌體的CD81含量在損傷后1d有明顯上升（圖4C）。

圖4 ? ExoView檢測(cè)血漿外泌體的粒徑、數(shù)量、熒光強(qiáng)度和共定位

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參考文獻(xiàn)：

[1] Scherr, S. M., Daaboul, G. G., Trueb, ? J., Sevenler, D., Fawcett, H., Goldberg, B., ... & U?nlu?, M. S. (2016). Real-time capture and ? visualization of individual viruses in complex media. ACS nano, 10(2), ? 2827-2833.

[2] Kyoung-Won Ko, So-Yeon Park, Eun Hye ? Lee, Yong-In Yoo, Da-Seul Kim, Jun Yong Kim, Tae Gyun Kwon and Dong Keun Han. ? (2021). Integrated Bioactive Scaffold with Polydeoxyribonucleotide and Stem-Cell-Derived Extracellular Vesicles for Kidney Regeneration. ACS Nano, ? 15(4): 7575?7585.

[3] Enkhtuya Radnaa, Lauren S. ? Richardson, Samantha Sheller-Miller, Tuvshintugs Baljinnyam, ...& Ramkumar ? Menon. (2021). Extracellular vesicle mediated feto-maternal HMGB1 signaling ? induces preterm birth. Lab on a Chip, DOI: 10.1039/D0LC01323D.

[4] Khan, N. Z., Cao, T., He, J., Ritzel, ? R. M., Li, Y., Henry, R. J., ... & Wu, J. (2021). Spinal cord injury ? alters microRNA and CD81+ exosome levels in plasma extracellular ? nanoparticles with neuroinflammatory potential. Brain, behavior, and ? immunity, Volume 92: 165-183.

全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)（ExoView R100）簡(jiǎn)介

Nanoview所開(kāi)發(fā)的全自動(dòng)外泌體熒光檢測(cè)分析系統(tǒng)（ExoView R100）采用單粒子干涉反射成像傳感器（SP-IRIS）技術(shù)，是一款無(wú)需純化的全自動(dòng)的新型外泌體表征設(shè)備。該設(shè)備能夠提供全方位的外泌體表征信息，包括顆粒大小、計(jì)數(shù)、表型與生物標(biāo)志物共定位等，提供多層次和全面的外泌體測(cè)量解決方案。

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