2016年12月16日，清華大學生命學院、結(jié)構(gòu)生物學高精尖創(chuàng)新中心施一公教授研究組于《科學》(Science)雜志就剪接體的結(jié)構(gòu)與機理研究再發(fā)長文(Research Article)，題為《酵母剪接體處于第二步催化激活狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)》(Structure of a Yeast Step II Catalytically Activated Spliceosome)，報道了釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)剪接體在即將開始第二步剪接反應(yīng)前的工作狀態(tài)下的三維結(jié)構(gòu)，闡明了剪接體在第一步剪接反應(yīng)完成后通過構(gòu)象變化起始第二步反應(yīng)的激活機制，從而進一步揭示了前體信使RNA剪接反應(yīng)(pre-mRNA splicing，以下簡稱RNA剪接)的分子機理。

　　由于真核生物中的基因編碼區(qū)中存在不翻譯成蛋白質(zhì)的序列(稱為內(nèi)含子)，染色體DNA轉(zhuǎn)錄出來的前體mRNA(pre-mRNA)并不直接參與蛋白質(zhì)翻譯，而是需要先將其中的內(nèi)含子片段去除，才能進入核糖體進行蛋白質(zhì)合成。內(nèi)含子的去除需要通過兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)來實現(xiàn)：首先，位于內(nèi)含子序列中下游被稱為分支點(branch point sequence)的序列中有一個高度保守的腺嘌呤核苷酸(A)，其2’羥基親核攻擊內(nèi)含子5’末端的鳥嘌呤(G)，于是第一步反應(yīng)發(fā)生，形成套索結(jié)構(gòu);然后，5’外顯子末端暴露出的3’-OH向內(nèi)含子3’末端的鳥嘌呤發(fā)起攻擊，第二步反應(yīng)發(fā)生，兩個外顯子連在一起。通過這兩步反應(yīng)，前體信使RNA中數(shù)量、長度不等的內(nèi)含子被剔除，剩下的外顯子按照特異順序連接起來從而形成成熟的信使RNA(mRNA)(圖1)。

圖1 基因剪接反應(yīng)示意圖(圖片來源：《Cell》)

　　這兩步化學反應(yīng)在細胞內(nèi)是由一個龐大、復雜而動態(tài)的分子機器——剪接體催化完成的。對于每一個內(nèi)含子來說，為了調(diào)控反應(yīng)的各個基團在適當時機呈現(xiàn)合適的構(gòu)象從而發(fā)揮其活性，剪接體各組分按照高度精確的順序結(jié)合和解離，組裝成一系列具有不同構(gòu)象的分子機器，統(tǒng)稱為剪接體。根據(jù)它們在RNA剪接過程中的生化性質(zhì)，這些剪接體又被區(qū)分為B、Bact、B*、C、P、ILS等若干狀態(tài)。獲取剪接體在組裝、激活、催化反應(yīng)過程中各個狀態(tài)的結(jié)構(gòu)是最基礎(chǔ)也是最富挑戰(zhàn)性的結(jié)構(gòu)生物學難題之一。

　　2015年8月，施一公研究組率先突破，在世界上首次報道了裂殖酵母剪接體處于ILS狀態(tài)的3.6埃高分辨率結(jié)構(gòu)。2016年7月22日，施一公教授研究組在《科學》在線發(fā)表背靠背長文，首次報道了釀酒酵母剪接體分別處于激活狀態(tài)(activated spliceosome，又稱為Bact complex)和第一步催化反應(yīng)后(catalytic step I spliceosome，又稱為C complex)的近原子分辨率的剪接體結(jié)構(gòu)，首次完整地展示了第一步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)前后pre-mRNA和其中起催化作用的snRNA的反應(yīng)狀態(tài)，以及剪接體內(nèi)部蛋白組分的組裝情況。但是對于剪接體催化第二步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的細節(jié)，至今沒有高分辨率的結(jié)構(gòu)加以佐證。

　　在最新發(fā)表的《科學》長文中，施一公教授研究組捕獲了性質(zhì)良好的釀酒酵母剪接體樣品，并利用先進的單顆粒冷凍電鏡技術(shù)和高效的數(shù)據(jù)分類方法，重構(gòu)出了總體分辨率分別為4.0埃的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，首次報道了酵母第二步催化激活狀態(tài)下的剪接體結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)的解析，進一步補充了mRNA剪接過程的關(guān)鍵信息，描述了從第一步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)到第二步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)過程中，剪接體催化反應(yīng)活性中心內(nèi)部組分的變化，以及關(guān)鍵蛋白的參與情況，為理解第二步反應(yīng)所需的3’剪接位點是如何進入活性位點提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。值得關(guān)注的是，該結(jié)構(gòu)的催化核心區(qū)域的分辨率達到3.5埃，第一次展示了轉(zhuǎn)酯反應(yīng)進行中的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)信息，填寫了第二步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)細節(jié)信息的空白。

　　2015年8月至今，施一公教授研究組共報道了剪接反應(yīng)中5個關(guān)鍵狀態(tài)剪接體復合物的高分辨率結(jié)構(gòu)，分別是3.8埃的預組裝復合物tri-snRNP、3.5埃的激活狀態(tài)復合物Bact complex、3.4埃的第一步催化反應(yīng)后復合物C complex、4.0埃的第二步催化激活狀態(tài)下的C* complex以及3.6埃的內(nèi)含子套索剪接體ILS complex。這5個高分辨率結(jié)構(gòu)所代表的剪接體狀態(tài)，基本覆蓋了整個剪接通路中關(guān)鍵的催化步驟，提供了迄今為止最為清晰的剪接體不同工作狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)信息，大大推動了RNA剪接研究領(lǐng)域的發(fā)展。

　　施一公教授為本文的通訊作者;清華大學生命學院博士后結(jié)構(gòu)生物學高精尖創(chuàng)新中心卓越學者閆創(chuàng)業(yè)、醫(yī)學院四年級博士生萬蕊雪以及生命學院二年級博士生白蕊為該文的共同第一作者;生命學院二年級博士黃高興宇參與了這項研究;電鏡數(shù)據(jù)采集于清華大學冷凍電鏡平臺，計算工作得到清華大學高性能計算平臺、國家蛋白質(zhì)設(shè)施實驗技術(shù)中心(北京)以及榮之聯(lián)董事長王東輝先生的支持。本工作獲得了北京市結(jié)構(gòu)生物學高精尖創(chuàng)新中心及國家自然科學基金委的經(jīng)費支持。

圖2 C* complex三維結(jié)構(gòu)示意圖