為了滿足考察自然界中細(xì)胞“原位功能”這一共性科學(xué)需求，“現(xiàn)場(chǎng)”、“實(shí)時(shí)”的單細(xì)胞分選與測(cè)序已成為生命科學(xué)裝備研制領(lǐng)域的一個(gè)重要發(fā)展趨勢(shì)。盡管第三代測(cè)序技術(shù)已實(shí)現(xiàn)儀器微型化，但與測(cè)序?qū)拥膯渭?xì)胞精準(zhǔn)分選裝備卻仍然相當(dāng)笨重和昂貴，難以支撐各種科學(xué)考察中針對(duì)微生物組功能的現(xiàn)場(chǎng)分析。最近，中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所單細(xì)胞研究中心研究員馬波帶領(lǐng)的微流控系統(tǒng)團(tuán)隊(duì)，通過(guò)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)易高效的單細(xì)胞分選與測(cè)序?qū)友b置，實(shí)現(xiàn)了每個(gè)試管有且只有一個(gè)細(xì)胞(One-Cell-One-Tube)，有望服務(wù)于“現(xiàn)場(chǎng)”、“實(shí)時(shí)”乃至“便攜式”的單細(xì)胞分選與測(cè)序。

　　與人體和高等動(dòng)植物細(xì)胞相比，微生物細(xì)胞通常更小(0.1-10 微米)，更加難于精準(zhǔn)操縱，因此分離獲取目標(biāo)單細(xì)胞、并且實(shí)現(xiàn)測(cè)序反應(yīng)要求的“One-Cell-One-Tube”是一個(gè)關(guān)鍵難點(diǎn)。目前的自動(dòng)單細(xì)胞分離方法大多依賴于昂貴且體積龐大的熒光流式細(xì)胞分選儀(FACS)，而現(xiàn)有的手動(dòng)單細(xì)胞分離和測(cè)序方案在依賴于操作人員熟練程度的同時(shí)，同樣需要顯微單細(xì)胞移液平臺(tái)、激光光鑷等同樣難以隨身攜帶的大中型儀器。此外，單細(xì)胞分選及核酸制備過(guò)程極易受到環(huán)境中飄浮微生物及其DNA的污染，而且這種污染通常難以在測(cè)序數(shù)據(jù)處理環(huán)節(jié)完全去除。因此，盡管目前MinION等第三代測(cè)序儀已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了便攜化，微生物單細(xì)胞分選和測(cè)序仍然操作繁瑣、污染干擾嚴(yán)重，難以滿足要求。

　　針對(duì)上述挑戰(zhàn)，青島能源所單細(xì)胞中心張強(qiáng)和王婷婷等發(fā)明了一種名為“FOCOT”(Facile One-Cell-One-Tube的縮寫(xiě))的方法，能夠精確、高速、低成本地分離、獲取與分裝單個(gè)微生物細(xì)胞，從而與單細(xì)胞測(cè)序直接對(duì)接。該方法具體為：首先，通過(guò)微流控技術(shù)，將細(xì)胞分散包裹在數(shù)十微米直徑的油包水微液滴中;其次，基于液滴顯微光學(xué)成像識(shí)別技術(shù)，分選出單細(xì)胞包裹液滴;第三，將單細(xì)胞包裹液滴順序分布于系列試管中，從而快速實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞的分離，以及每個(gè)試管有且只有一個(gè)細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)與單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增與測(cè)序的直接對(duì)接。

　　FOCOT平臺(tái)主要有三個(gè)特色。第一，在簡(jiǎn)易方便方面，F(xiàn)OCOT平臺(tái)除自行設(shè)計(jì)的芯片之外，僅需要電磁閥、平板電腦和普通光學(xué)顯微鏡，不需外接任何高成本商品化儀器平臺(tái)，具有易獲取、易替換、低成本等優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，模塊化、小型化、操作簡(jiǎn)便的設(shè)計(jì)使得該裝置適合在自然環(huán)境實(shí)地采樣條件下的攜帶、裝配和使用，也幾乎不需要額外的人員培訓(xùn)和技術(shù)維護(hù)，因此尤其適用于面向各種極端自然環(huán)境的科學(xué)考察，也有利于在普通實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用。第二，在分選高效方面，F(xiàn)OCOT平臺(tái)通過(guò)顯微鏡下對(duì)包裹有單個(gè)細(xì)胞的液滴的準(zhǔn)確識(shí)別和分選，能有效避免假陽(yáng)性;而且其20秒/個(gè)的分選速度，與顯微單細(xì)胞移液、激光光鑷等現(xiàn)有的商品化分選裝備相比具有明顯優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，單細(xì)胞獲取率高于90%，培養(yǎng)成功比例至少80%，證明該方法能有效避免芯片表面吸附所導(dǎo)致的輸運(yùn)過(guò)程中細(xì)胞流失，而且對(duì)細(xì)胞活性沒(méi)有或較小損傷。第三，在污染控制方面，F(xiàn)OCOT平臺(tái)涉及部件少，體積小型化，相對(duì)封閉，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中能夠方便地實(shí)現(xiàn)超潔凈環(huán)境空間控制、芯片消毒等操作，嚴(yán)格控制環(huán)境DNA的污染。對(duì)分離獲取的單個(gè)酵母細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增與測(cè)序后結(jié)果顯示，99%的有效序列可以與參考基因組匹配，表明該方法能有效避免環(huán)境中微生物帶來(lái)的DNA污染，平均基因組覆蓋率達(dá)到43.3%，與在昂貴的超凈空間設(shè)施中采用FACS等大型儀器系統(tǒng)分離獲取單細(xì)胞所獲得的測(cè)序結(jié)果相當(dāng)。

　　目前，通過(guò)耦合FOCOT與中心前期開(kāi)發(fā)的單細(xì)胞拉曼成像、拉曼流式細(xì)胞分選等技術(shù)，單細(xì)胞中心正在構(gòu)建一個(gè)服務(wù)于岸基、船基乃至手基等不同需求的非標(biāo)記式單細(xì)胞分析裝備體系，以服務(wù)于能源、環(huán)境、健康、海洋、土壤等諸多微生物組應(yīng)用領(lǐng)域。

　　相關(guān)研究論文發(fā)表在《科學(xué)報(bào)告》上。研究工作由單細(xì)胞中心馬波和徐健共同主持完成，獲得了國(guó)家基金委科學(xué)儀器基礎(chǔ)研究專項(xiàng)、面上項(xiàng)目和中科院生物高通量分析技術(shù)服務(wù)網(wǎng)絡(luò)(STS)等項(xiàng)目的支持。

　　論文信息：Development of a facile droplet-based single-cell isolation platform for cultivation and genomic analysis in microorganisms. Sci Rep, 7:41192, DOI: 10.1038/srep41192。

FOCOT方法示意圖