2月10日，清華大學醫(yī)學院顏寧研究組在《科學》(Science)在線發(fā)表題為《真核生物電壓門控鈉離子通道的近原子分辨率三維結(jié)構(gòu)》(Structure of a eukaryotic voltage-gated sodium channel at near atomic resolution)的研究長文，在世界上首次報道了真核生物電壓門控鈉離子通道(以下簡稱“鈉通道”)的3.8埃分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，為理解其作用機制和相關疾病致病機理奠定了基礎。

　　清華大學生命學院五年級博士生申懷宗、醫(yī)學院副研究員周強、醫(yī)學院博士后潘孝敬、生命學院二年級博士生李張強和生命學院五年級博士生吳建平為該文章共同第一作者。通訊作者是清華大學醫(yī)學院拜耳講席教授以及霍華德休斯醫(yī)學研究院國際青年科學家顏寧。

真核生物電壓門控鈉離子通道的拓撲圖和三維電鏡結(jié)構(gòu)。

　　重要性

　　上世紀四五十年代，英國科學家霍奇金和赫胥黎發(fā)現(xiàn)了動作電位;之后發(fā)現(xiàn)電壓門控鈉離子通道(Nav通道)引發(fā)動作電位，而電壓門控鉀離子通道(Kv通道)則終結(jié)動作電位，恢復至靜息狀態(tài)。自此科學界展開了針對鈉通道方方面面延續(xù)至今的系統(tǒng)研究;可以說，對鈉通道的研究構(gòu)成了過去60多年電生理研究的重要基石。

　　鈉通道是所有動物中電信號的主要啟動鍵，而電信號則是神經(jīng)活動和肌肉收縮等一系列生理過程的控制基礎。在人體中，一共有九種已知的電壓門控鈉離子通道亞型，在不同的器官和生理過程中發(fā)揮作用。鈉通道的異常會導致一系列與神經(jīng)、肌肉和心血管相關的疾病，特別是癲癇、心律失常和持續(xù)性疼痛或者無法感知痛覺等;迄今已經(jīng)在人體的九種鈉通道蛋白中發(fā)現(xiàn)了一千多個與已知疾病相關的點突變。此外，鈉通道也是許多局部麻醉劑以及自然界中大量的神經(jīng)毒素的直接靶點，許多蛇毒、蝎毒、蜘蛛毒素等，都是作用于鈉離子通道而產(chǎn)生不良后果。

　　鈉通道是諸多國際制藥公司的研究靶點，有著巨大的制藥前景。獲取鈉通道的精細三維結(jié)構(gòu)對于理解其工作機理以及制藥至關重要。

　　技術難度

　　除了作為膜蛋白通常具有的技術難度之外，對于真核鈉通道高分辨率三維結(jié)構(gòu)的解析還存在著幾道額外的很難逾越的“路障”。

　　首先，獲取蛋白樣品難。真核生物鈉離子通道蛋白全長包含約2000個氨基酸，很難對其像電壓門控鉀離子通道那樣進行大量的體外重組表達;內(nèi)源鈉通道通常含量極低，很難像電壓門控鈣離子通道那樣從生物組織直接純化出足夠的用于結(jié)構(gòu)解析的高質(zhì)量蛋白樣品。

　　其次，鈉通道是由一條肽鏈折疊而成，具有假四次對稱特征。與同源四聚體的鉀通道相比，鈉通道很難結(jié)晶或者利用冷凍電鏡技術獲取結(jié)構(gòu);它們又不像鈣通道那樣與輔助亞基形成較大分子量的穩(wěn)定復合體，從而增大了利用電鏡技術解析結(jié)構(gòu)的難度。

　　最后，真核鈉通道包含有比較多的柔性區(qū)域，還存在著多種多樣的翻譯后修飾，這都對其結(jié)構(gòu)解析構(gòu)成很大挑戰(zhàn)。

　　也因此，對于真核鈉通道的結(jié)構(gòu)生物學研究遠遠滯后于早在2003年即獲得首個晶體結(jié)構(gòu)的電壓門控鉀離子通道。包括歐美英日在內(nèi)的全球數(shù)十個研究團隊都在緊鑼密鼓攻堅，力圖獲得首個真核鈉通道的高分辨率結(jié)構(gòu)。

　　突破點

　　在最新的《科學》論文中，顏寧研究組成功地克服了以上的層層瓶頸，獲得了性質(zhì)良好的蛋白樣品，并利用單顆粒冷凍電鏡的方法，重構(gòu)出了可以清晰分辨絕大多數(shù)側(cè)鏈的真核生物鈉離子通道(命名為NavPaS)的三維結(jié)構(gòu)。研究組利用電鏡技術，同時反其道而行之，放棄了對于大分子量蛋白的追求，而利用序列分析選取長度最短的真核鈉離子通道，成功利用重組技術獲得了表達量較高、性質(zhì)穩(wěn)定均一的美洲蟑螂(電生理重要模式生物之一)的鈉通道蛋白。該結(jié)構(gòu)的解析為理解鈉通道的離子選擇性、電壓依賴的激活與失活特性、配體抑制機理提供了重要的分子基礎，為解釋過去60多年的大量實驗數(shù)據(jù)提供了結(jié)構(gòu)模板，并為基于結(jié)構(gòu)的分子配體開發(fā)奠定了基礎。

　　十年鑄劍

　　值得一提的是，顏寧自2007年在清華大學醫(yī)學院建立實驗室伊始即開始了針對電壓門控鈉離子和鈣離子通道的結(jié)構(gòu)生物學攻堅，并于2012年在《自然》報道了來自一種海洋細菌的鈉離子通道NavRh處于失活狀態(tài)的晶體結(jié)構(gòu)。此后，課題組又在國際上首次報道了真核生物電壓門控鈣離子通道Cav1.1的高分辨率結(jié)構(gòu)，為理解相關生理過程(包括但不限于肌肉收縮偶聯(lián)過程)的分子機理打下了重要基礎。歷經(jīng)十年，顏寧實驗室解析了真核電壓門控鈉離子通道的結(jié)構(gòu)。至此，所有經(jīng)典的電壓門控陽離子通道都有了三維結(jié)構(gòu)模板，而其中由單鏈折疊而成的真核鈣離子和鈉離子通道結(jié)構(gòu)都是顏寧實驗室率先獲得，奠定了其團隊在該領域的國際領先地位。

　　本研究獲得了清華大學冷凍電鏡平臺雷建林博士、李小梅和李曉敏的大力支持，數(shù)據(jù)采集于清華大學于2009年購置的Titan Krios冷凍電鏡。國家蛋白質(zhì)科學中心(北京)清華大學冷凍電鏡平臺和清華大學高性能計算平臺分別為本研究的數(shù)據(jù)收集和數(shù)據(jù)處理提供了支持。科技部、基金委、生命科學聯(lián)合中心-清華大學、生物膜與膜生物工程國家重點實驗室為本研究提供了經(jīng)費支持。本研究還獲得了清華大學醫(yī)學院和生命學院肖百龍、熊巍、陶慶華、塞西莉亞·卡捏莎(Cecilia Canessa)等實驗室的幫助。