抗生素的不當(dāng)使用一方面貽誤病情、導(dǎo)致復(fù)發(fā)感染，甚至造成人體菌群紊亂，誘導(dǎo)其它疾病的發(fā)生，另一方面則加速耐藥菌乃至“超級細菌”的出現(xiàn)。因此，如何實現(xiàn)“快、準(zhǔn)、狠”的抗生素精準(zhǔn)用藥既是精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的重要前沿，也是遏制耐藥性蔓延的核心挑戰(zhàn)之一。而準(zhǔn)確全面的抗菌效果評價技術(shù)是抗生素精準(zhǔn)用藥的前提與基礎(chǔ)。近日，中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所單細胞中心與中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院合作發(fā)表了基于重水標(biāo)記單細胞拉曼成像的藥物抗菌效果評價技術(shù)，在單個細菌細胞精度快速測量藥物對細胞代謝活性的抑制性。以此為基礎(chǔ)提出的“基于代謝活性的最低抑菌濃度”(“MIC-MA”指數(shù))，與目前臨床用藥普遍依據(jù)的“最低抑菌濃度”(“MIC”指數(shù))相比具有重要的特色與優(yōu)勢，因此有望成為指導(dǎo)臨床精準(zhǔn)用藥的新標(biāo)準(zhǔn)之一。該工作近期發(fā)表于《分析化學(xué)》(Analytical Chemistry)。

　　據(jù)專家估算，目前在必須使用抗生素治療的臨床案例中，高達30~50%存在著治療方案制定、抗生素選擇或抗生素療程等方面的錯誤;在重癥監(jiān)護中，約30~60%的抗生素處方均存在非必要抗生素的濫用、非對癥抗生素或者非最佳抗生素組合方案等問題。與此同時，目前每年約有70萬人死于耐藥菌感染;到2050年，這一數(shù)目將激增至每年1000萬人，大約為每年死于各種癌癥的病人總數(shù)。因此，2016年9月22日聯(lián)合國大會193個成員國共同簽署了歷史性宣言，承諾通力合作掃除“超級耐藥病菌”。2016年8月26日中國國家衛(wèi)計委等14部門聯(lián)合印發(fā)的《遏制細菌耐藥國家行動計劃(2016-2020)》中明確提出，要“加強抗菌藥物應(yīng)用和耐藥控制體系建設(shè)”和“完善抗菌藥物應(yīng)用和細菌耐藥監(jiān)測體系”。準(zhǔn)確全面的抗菌效果評價技術(shù)是抗生素精準(zhǔn)用藥的前提與基礎(chǔ)，但是，臨床需求與技術(shù)現(xiàn)狀的矛盾如此緊迫和突出，以至于2016年9月8日美國NIH懸賞二千萬美元，專門激勵細菌耐藥性臨床快檢技術(shù)的研發(fā)。

　　迄今為止，MIC指數(shù)，即體外培養(yǎng)細菌24小時后能抑制培養(yǎng)基內(nèi)病原菌生長的最低藥物濃度，一直是微生物藥敏試驗、抗菌藥效評價和臨床抗菌方案制定的主流標(biāo)準(zhǔn)與主要依據(jù)之一。然而其測量不僅耗時耗力，且對難以實驗室培養(yǎng)或生長緩慢的病菌無能為力。尤其關(guān)鍵的是，MIC只能從抑制細胞數(shù)目擴增這一角度反映與測量藥效，卻無法檢測處于“NGMA”(Non-Growing but Metabolically Active)狀態(tài)的病菌，即在藥物作用下已經(jīng)不再增殖但仍然具備代謝活性的存活細胞。這種狀態(tài)的病菌在臨床上十分常見，如果在抗菌治療中成為漏網(wǎng)之魚，將貽誤病情，引起復(fù)發(fā)性感染，進而誘導(dǎo)耐藥菌乃至“超級細菌”的頻繁出現(xiàn)。因此根據(jù)MIC制定抗菌治療方案有可能出現(xiàn)“不夠快、不夠準(zhǔn)、不夠狠”的情況。

　　針對上述瓶頸問題，研究人員開發(fā)了基于拉曼組(Ramanome)的細菌藥物應(yīng)激效應(yīng)成像技術(shù)(如圖)，有效地克服了上述缺陷。該研究以導(dǎo)致齲病的變形鏈球菌(Streptococcus mutans)與多種臨床常見抗菌藥物為模式，證明單細胞拉曼成像能夠精確測量細胞利用胞外重水(D2O)分子的速率，而后者與該細胞的代謝活躍程度呈高度的正相關(guān)。因此與重水標(biāo)記耦合的單細胞拉曼成像能夠從對微生物代謝活性抑制的角度定量測量藥效，讓處于“NGMA”狀態(tài)的細胞無所遁形，從而使抗菌治療方案“夠準(zhǔn)”。同時，由于該方法具備單個細菌細胞的精度，因此對于絕大部分細菌、古菌和真菌，該方法能夠測量同一樣品內(nèi)不同細胞之間在抗菌效應(yīng)上的差異程度，評價病菌細胞群體或群落在藥物作用下是否已被“趕盡殺絕”，從而使抗菌治療方案“夠狠”。實驗還證明，該方法能夠在半小時內(nèi)快速區(qū)分氟耐受型和氟易感型的變形鏈球菌，這一高度靈敏性對于評價抗菌效果是否“夠快”具有重要意義。

　　基于上述重水標(biāo)記單細胞拉曼成像技術(shù)，研究人員提出了名為“基于代謝活性的最低抑菌濃度”(“MIC-MA”指數(shù))的抗菌藥效指標(biāo)，即藥物作用8個小時后所有細胞其代謝活性徹底、且全都被抑制的最低藥物劑量。對于特定病菌和特定抗菌藥物，MIC-MA指數(shù)與MIC指數(shù)顯著不同。在該研究測試的三種抗菌藥物的MIC劑量下，盡管變形鏈球菌細胞群體已經(jīng)不再生長與擴增，但大部分的細胞都仍然保持著一定的代謝活性。事實上，在高達60倍MIC的氨芐西林劑量時，仍然存在高比例的“NGMA”狀態(tài)的變形鏈球菌細胞，這導(dǎo)致在抗生素壓力消失時病菌“星火燎原”，發(fā)生復(fù)發(fā)性感染。這說明MIC-MA在評價抗菌藥效是否“快、準(zhǔn)、狠”等方面，與目前臨床上普遍參照的MIC相比，具有重要的特色與優(yōu)勢。

　　此外，傳統(tǒng)MIC檢測將受試微生物作為同質(zhì)化的群體來看待，忽視了針對細胞之間藥效異質(zhì)性的考察與評價。而MIC-MA在單個細胞精度的藥敏性與藥效檢測，對于研究考察耐藥性形成與微進化機制等方面具有重要意義。

　　單細胞中心前期已經(jīng)證明拉曼組能夠快速區(qū)分細胞藥物應(yīng)激機制(Teng L, et al, Sci Rep, 2016)。因此，拉曼組技術(shù)預(yù)期將成為指導(dǎo)“個體化”臨床精準(zhǔn)用藥與耐藥性快檢的新手段與新標(biāo)準(zhǔn)之一，同時，也為新型抗菌藥物篩選與研發(fā)提供了嶄新的共性技術(shù)平臺。

　　青島能源所單細胞中心研究員徐健和中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院教授凌均棨為論文的共同通訊作者，聯(lián)合培養(yǎng)博士生陶一帆是論文的第一作者。該工作獲得了國家自然科學(xué)基金委、中科院生物高通量檢測分析技術(shù)服務(wù)網(wǎng)絡(luò)(STS)等的支持。

　　論文信息：

　　Yifan Tao, Yun Wang, Shi Huang, Pengfei Zhu, Wei E. Huang, Junqi Ling*, Jian Xu*. Metabolic-activity based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled Single-Cell Raman Microspectroscopy. Anal. Chem., 2017, DOI:10.1021/acs.analchem.6b05051.

　　Lin Teng, Yun Wang, Xiaojun Wang, Honglei Gou, Ren Lihui, Tingting Wang, Yun Wang, Yuetong Ji, Wei E. Huang, Jian Xu, Label-free, rapid and quantitative phenotyping of stress response in E. coli via ramanome. Sci Rep, 2016. 6:34359. DOI:10.1038/srep34359.

基于重水標(biāo)記單細胞拉曼成像的藥物抗菌效果評價技術(shù)示意圖

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