從石器時代原始部落的祭師對靈魂的崇拜，到中世紀后期哲人對大腦意識的產(chǎn)生溯源，到近代解刨學家發(fā)現(xiàn)井然有序的大腦功能分區(qū)，再到20世紀初Santiago Cajal得到了人類第一張清晰的大腦皮層神經(jīng)元的照片，直至現(xiàn)在神經(jīng)學家通過電生理，電子顯微鏡，光學顯微鏡等手段，在亞細胞，分子，基因水平對大腦的結(jié)構(gòu)和功能進行研究，神經(jīng)科學(neurosciences)這一門古老的學科，直至今日，仍然是全世界投入最大，最活躍的科學研究領(lǐng)域之一。

　　限制科學家去理解和探索大腦的最主要因素是技術(shù)。每一次神經(jīng)領(lǐng)域的重大突破，都是以技術(shù)的一次次革命與飛躍作為基礎(chǔ)隨之而來。19世紀末高爾基染色和尼斯染色技術(shù)的發(fā)明，使得單個神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)得意完整清晰的呈現(xiàn)，并由現(xiàn)代神經(jīng)學之父圣地亞哥·拉蒙·卡哈爾(Santiago Ramon y Cajal,1852-1934)總結(jié)并開創(chuàng)了神經(jīng)元理論，至今仍是現(xiàn)代神經(jīng)科學的基礎(chǔ)。計算機體層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)、經(jīng)顱多普勒(TCD)、單光子發(fā)射計算機斷層(SPECT)、正電子發(fā)射斷層掃描(PET)等無創(chuàng)性影像學技術(shù)的發(fā)展，使得人類對大腦整體水平結(jié)構(gòu)和功能的認識不斷提高，并且對于大腦創(chuàng)傷和疾病的治療提供了有利的參考工具。在實驗神經(jīng)科學領(lǐng)域，以模式動物作為研究對象，避免了把人作為研究對象在有創(chuàng)，改造等倫理方面的限制，使得更多的技術(shù)手段得以大顯身手。其中包括電生理學方面，腦電圖(EEG)，多電極記錄(MER)，膜片鉗技術(shù)(patch clamp)等技術(shù)的發(fā)明和有效使用，得以使科學家在亞微米空間尺度(單個神經(jīng)突觸連接)，亞毫秒時間尺度(單次神經(jīng)沖動電位)對神經(jīng)元的功能進行研究。而最令人激動人心的是，近幾年來蓬勃發(fā)展的光學顯微成像技術(shù)，給實驗神經(jīng)科學帶來了很多前所未有的思路和成果。2008年錢永健等人由于熒光蛋白(GFP，綠色熒光蛋白)的發(fā)現(xiàn)和使用，獲得了諾貝爾化學獎，是對熒光成像技術(shù)的一次巨大肯定和推動。光學成像本身具有高分辨率、高通量(高速)、非侵入、非毒性等特點，再與熒光蛋白以及熒光染料等標記物在細胞中的定位與表達技術(shù)相結(jié)合，使得科學家可以特異性的分辨生物體乃至細胞內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)與成分，并且能夠在生命體和細胞仍具有活性的狀態(tài)下(活體狀態(tài))對其功能進行動態(tài)觀察。這就使得熒光成像技術(shù)成為了無可替代的，生物學家現(xiàn)今最為重要的技術(shù)手段之一。而隨著近些年來各種新型的顯微技術(shù)的出現(xiàn)，共聚焦顯微鏡(confocal microscopy)，相干拉曼成像(CARS)，超分辨率顯微技術(shù)(super-resolution microscopy)，光片顯微技術(shù)(lightsheet microscopy)等使得熒光顯微鏡的分辨率，速度，成像深度等進一步提高。

　　對于熒光成像技術(shù)在神經(jīng)科學中應(yīng)用，離不開雙光子熒光顯微鏡(Two-photon Microscopy，簡稱TPM)1。目前，大多數(shù)細胞生物學，生理學研究主要還是在離體培養(yǎng)的細胞體系中研究。然而與細胞生物學研究有所不同的是，大腦的功能研究的整體性和原位性顯得更加關(guān)鍵：僅研究分離的神經(jīng)元無法解釋神經(jīng)系統(tǒng)的功能和規(guī)律。換句話說，必須要求神經(jīng)元處在其正常生存的大腦環(huán)境中才能使其正常運轉(zhuǎn)。然而，大腦是一個高度復雜的器官。即使是小鼠的大腦皮層也有將近1mm的厚度，海馬，丘腦等深腦區(qū)核團更是深達3-5mm2，而且并不透明，充滿了數(shù)以億計的神經(jīng)元胞體和突觸，此外還有豐富的血管，粘膜(腦膜)，最外層還有厚厚的顱骨和頭皮包裹。使用包括共聚焦顯微鏡在內(nèi)的傳統(tǒng)的熒光顯微鏡，由于被觀測的信號會受到樣本組織的散射和吸收，根本無法穿透如此深的組織進行成像。而雙光子顯微鏡的發(fā)明，則為此類研究帶來了希望。雙光子顯微鏡特有的非線性光學特性，再加上其工作波長處在紅外區(qū)域等特點，令其在生物體組織內(nèi)的穿透深度大大提高3，使得雙光子顯微鏡成為神經(jīng)科學家進行活體神經(jīng)成像最理想的工具。神經(jīng)動作電位(action potential)本身很難被光學信號捕獲，但是動作電位產(chǎn)生的去極化會引起神經(jīng)元Ca2+濃度的變化(鈣內(nèi)流現(xiàn)象)。科學家已經(jīng)開發(fā)出多種Ca離子濃度的熒光探針，進而通過這種鈣離子濃度的變化引起的熒光信號的變化來反映出神經(jīng)活動。于是，雙光子顯微鏡與在體的神經(jīng)元Ca離子濃度指示劑標記技術(shù)相結(jié)合，碰撞出了耀眼的火花: 使得人們可以研究處于生理狀態(tài)時的動物大腦內(nèi)的神經(jīng)元活動4。

　　大腦的最重要功能是對生物體的行為活動進行調(diào)控，而反過來，最能反應(yīng)大腦工作狀態(tài)的同樣是生物體的行為活動。所以說，為了了解大腦，研究者不僅要求在體狀態(tài)下對神經(jīng)元進行高分辨率觀測，而且也希望生物體在被觀測的階段里，能夠進行正常的行為活動。所以，在成像技術(shù)不斷地提高分辨率和速度等性能的同時，科學家們也在積極開改進和革這些成像技術(shù)手段，使其進行成像時盡可能小的限制被觀測對象的行為活動，以求得到最接近生理狀態(tài)下的數(shù)據(jù)。但是這一目標始終存在諸多的技術(shù)瓶頸: 以嚙齒類動物(大鼠或小鼠)神經(jīng)元的雙光子鈣成像為例。早些年由于動物身體運動產(chǎn)生的晃動劇烈，而當時雙光子顯微鏡成像速度又很低，所以科學家只能在麻醉狀態(tài)下對頭部固定的動物進行成像。后來隨著成像速度的提高，并且對開顱手術(shù)技術(shù)的很大改進，使得科學家可以在清醒狀態(tài)下對動物的神經(jīng)活動進行觀察(仍然需要頭部固定)。近些年來，隨著基因改造技術(shù)的突飛猛進，通過病毒轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在神經(jīng)元內(nèi)源性表達“基因編碼類鈣指示劑(genetically encoded calcium indicator, 簡稱GECI)”成為神經(jīng)元鈣成像的大趨勢4。這種由神經(jīng)元自身產(chǎn)生鈣指示劑的方法與之前的鈣染料技術(shù)相比有著巨大的優(yōu)勢: 信噪比提升了一個數(shù)量級;對神經(jīng)元特異性好，可以區(qū)分不同的神經(jīng)元類型;并且可以在大腦神經(jīng)元內(nèi)持續(xù)表達數(shù)月(病毒轉(zhuǎn)染)甚至整個生命歷程(轉(zhuǎn)基因動物)。于是，大概10年前開始，科學家就開始利用雙光子成像結(jié)合GECI技術(shù)對神經(jīng)元的活動和結(jié)構(gòu)變化進行長期的觀測和追蹤，從而對記憶的形成，神經(jīng)元病變等問題有了更深入的認識。其中，現(xiàn)在性能最好，使用最為廣泛的GECI為綠色熒光鈣調(diào)蛋白Gcamp家族4。目前已經(jīng)改進到第六代，Gcamp6f，Gcamp6f已經(jīng)成為神經(jīng)成像里最受歡迎的指示劑之一。目前科學家最流行的對小動物行為過程中大腦活動進行成像的方法，是將虛擬現(xiàn)實與雙光子成像相結(jié)合，在動物頭部被固定的情況下，在其眼前制造影像，讓動物認為自己處在”真實“的環(huán)境之中5。通過小鼠四肢在類似跑步機或者鼠標滾球上的運動來模擬其真實活動。以求達到研究神經(jīng)元在動物行為中所起到的作用(如圖1)。

圖1 雙光子成像結(jié)合虛擬現(xiàn)實場景，對頭部固定，身體活動的動物進行研究。圖片來自5

　　然而，這種虛擬現(xiàn)實加頭部固定成像的方法，已經(jīng)遭到許多科學家的質(zhì)疑。人們認為，頭部固定的動物在實驗期間一直處在物理約束和情緒壓力下，因此無法證明神經(jīng)元對外界的響應(yīng)在虛擬現(xiàn)實和自由探索下是等價的。更重要的是，許多社會行為，比如親子護理，交配和戰(zhàn)斗，都不能用頭部固定的實驗來研究。如何在動物自由活動的時候，直接對其神經(jīng)元進行成像，是神經(jīng)科學家還未能得到解決終極的訴求。

　　一個理想的解決方案是開發(fā)微型熒光顯微鏡直接固定在自由活動的動物身上，讓動物“帶著顯微鏡跑”6。這種嘗試大概從20年前開始。起初，科學家只是將一根或幾根光纖插到小鼠頭上，用以激光導入和熒光信號采集。然而，這種方式而只是記錄某個區(qū)域內(nèi)信號的總和，不具有空間分辨率，算不上真正意義上的成像。在最近的十幾年里，由于光學，電子，材料技術(shù)的發(fā)展，人們開始嘗試研制真正意義上的微型顯微鏡。其中，微型單光子寬場顯微鏡(miniature wide-field microscope)，由于其原理與結(jié)構(gòu)相對簡單，是目前人們主要嘗試研制的微型顯微鏡技術(shù)。例如由Ghosh及其同事開發(fā)的顯微鏡，通過將小型LED光源，微型CCD和自聚焦透鏡整合到一個小于25px3的框架之中，研制出了一個重量為1.9g的微型寬場顯微鏡。該技術(shù)被用于研究大腦海馬區(qū)place cell等與記憶和本能相關(guān)的實驗當中7。然而，寬場成像方式由于不能很好的對離焦區(qū)域的背景信號進行過濾，并且對光的散射敏感，所以其無法達到細胞分辨率。更難以對更精細的諸如樹突，軸突，樹突棘等結(jié)構(gòu)進行觀察。所以一直難以達到神經(jīng)科學家滿意。

　　于是，從大概15年前開始，世界上一些研究和開發(fā)雙光子成像技術(shù)的研究組開始嘗試將雙光子顯微鏡這種在神經(jīng)成像領(lǐng)域已經(jīng)獲得廣泛應(yīng)用的技術(shù)進行微型。然而，目前只有為數(shù)不多的幾個課題組報道了他們在微型雙光子顯微鏡研制方面的進展: 在2001年，Denk等的工作被認為是研制微型雙光子顯微鏡的第一步8。然而，它仍然太過“巨大”(長7.5厘米，重25克)，而且成像速度很慢(2 Hz 128x128的尺寸下速度為2 Hz， 512x512的尺寸下為0.5 Hz，如圖2a)。之后，其他一些課題組相繼報道了不同的微型雙光子系統(tǒng)。 Helmchen課題組在2008年報道了他們的微型雙光子系統(tǒng)，僅重0.9克9。它實現(xiàn)了512X512幅面下的8 fps的成像速度速度，并展示了利用該系統(tǒng)實現(xiàn)的大鼠在體鈣成像信號。然而，從展示的效果來看，其空間分辨率極低，而且并沒有實現(xiàn)真正的自由運動下的成像(如圖2b)。Mark Schnitzler課題組在2009年也發(fā)表了他們的微型雙光子系統(tǒng)10。他們的系統(tǒng)首次使用了微機電掃描鏡(MEMS)來進行掃描，并將Z聚焦模塊集成在了探頭之中(如圖2c)。但是掃描頻率仍然很低(400x135約為4Hz);空間分辨率也遠遠達不到要求(橫向1.29 μm，軸向10.3 μm)。這些方面限制了其在神經(jīng)元細胞核亞細胞水平成像中的應(yīng)用。 Kerr課題組在2009年展示了它們的系統(tǒng)11，跟之前的微型雙光子顯微鏡相比較，由于應(yīng)用了微型透鏡組構(gòu)成的微型物鏡(NA達到了0.9)，這套系統(tǒng)的空間分辨率更高。然而，這套探頭的重量也隨之提高(5.5g)。此外，由于其仍然使用振動光纖的方式來進行掃描，所以其成像速度仍然比較慢。(對于64x64為10.9Hz，對于理論上的512x512為1.25Hz)(如圖2d)。此外，還有一個之前所有的微型雙光子系統(tǒng)都沒有解決的問題。由于微型雙光子顯微鏡一般需要利用光纖將飛秒激光導入到探頭之中，而光纖由于存在諸如色散、截至模式、導通帶寬等一系列限制，所以某一款光纖一般只允許一定帶寬(一般為幾十納米)和特定中心波長的光傳播。那就需要在制作微型顯微鏡的時候，結(jié)合使用的熒光指示劑所需要的激光波長對光纖進行選擇。但是，目前商業(yè)化的，可以用來進行飛秒光傳輸?shù)目招墓庾泳w光纖(hollow-core Photonic Crystal Fiber， HC-PCF)種類非常有限。例如，全球最大的光子晶體光纖生產(chǎn)商NKT公司僅提供中心波長為800nm，1030nm，1300nm和1550nm的HC-PCF。所有現(xiàn)有的微型雙光子顯微成像系統(tǒng)都是基于這幾款光纖所限定的中心波長進行開發(fā)的。但是很遺憾的是，本文上述所提到的目前最廣泛使用的GcamP指示劑需要920 nm的激光進行激發(fā)。所以先前的所有微型雙光子都不能對Gcamp進行有效的成像。這限制了微型雙光子顯微鏡的發(fā)展。

圖2 微型雙光子發(fā)展史上的幾個典型工作。a、b、c、d分別選自參考文獻8、9、10和11

　　之所以這些早期的微型化雙光子顯微鏡都無法得到真正的使用和推廣，其原因在于，若要制造出具有實用價值的微型雙光子顯微鏡，比研制單光子微型顯微鏡復雜和困難的多得多。微型雙光子顯微鏡需要需要解決如下幾個關(guān)鍵技術(shù)難題：

　　1 如何將飛秒激光有效的導入微型顯微鏡;

　　2 如何在微型顯微鏡內(nèi)進行掃描/圖像重建;

　　3 如何在微型顯微鏡中進行高質(zhì)量的激光匯聚，高效激發(fā)雙光子信號。

　　4 如何有效的對熒光信號進行收集;

　　5 如何使整個系統(tǒng)在動物劇烈運動時仍保持穩(wěn)定

　　6 在滿足前5項條件下，重量是否足夠輕，以致盡量小地對動物的活動造成影響;

　　本文作者所在的課題組，是由北京大學分子醫(yī)學研究所、信息科學技術(shù)學院、動態(tài)成像中心、生命科學學院、工學院聯(lián)合中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院組成跨學科團隊。我們在程和平院士的帶領(lǐng)下，在國家自然科學基金委國家重大科研儀器研制專項《超高時空分辨微型化雙光子在體顯微成像系統(tǒng)》的支持下，歷經(jīng)三年多的協(xié)同奮戰(zhàn)，成功研制了新一代高速高分辨微型雙光子熒光顯微鏡，并將其取名為FHIRM-TPM。原始論文于5月29日在線發(fā)表于自然雜志子刊Nature Methods (IF 25.3)12。在這項成果中，我們解決了上文所提及的早先微型化雙光子顯微鏡研制中存在的問題，獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動清晰、穩(wěn)定的圖像。

圖3 FIRM-TPM示意圖，來自12

　　新一代微型雙光子熒光顯微鏡體積小，重僅2.2克，適于佩戴在小型動物頭部，通過顱窗實時記錄數(shù)十個神經(jīng)元、上千個神經(jīng)突觸的動態(tài)信號。在大型動物上，還可望實現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長時程觀測。相比單光子激發(fā)，雙光子激發(fā)具有良好的光學斷層、更深的生物組織穿透等優(yōu)勢，所以成像質(zhì)量遠優(yōu)于目前領(lǐng)域內(nèi)主導的、美國腦科學計劃核心團隊所研發(fā)的微型化寬場顯微鏡。其橫向分辨率達到0.65μm，與商品化大型臺式雙光子熒光顯微鏡可相媲美;采用雙軸對稱高速微機電系統(tǒng)轉(zhuǎn)鏡掃描技術(shù)，成像幀頻已達40Hz(256*256像素)，同時具備多區(qū)域隨機掃描和每秒1萬線的線掃描能力。最為重要的是，F(xiàn)HIRM-TPM克服了先前限微型雙光子顯微鏡應(yīng)用的兩個障礙。首先，我們定制設(shè)計的HC-PCF為 920納米飛秒激光脈沖提供了無畸變傳輸，這種改進讓有效的激發(fā)例如Thy1-GFP和GCaMP-6f等常用熒光指示劑成為可能。第二，由于雙光子點掃描顯微鏡的高空間分辨率和層切能力，安裝到動物頭上的微型雙光子顯微鏡非常容易受到運動偽影的影響。為了解決這個問題，我們對整個系統(tǒng)進行了充分的優(yōu)化：(a)使用柔軟的新型光纖束SFB來使得動物運動引起的扭矩和拉拽力最小化，并不降低光子收集效率; (b)采用獨立的可旋轉(zhuǎn)連接器來連接光學探頭上的光纖和電線，以使動物在自由探索期間線的扭曲和纏繞最小化;(c)使用高速成像以減少運動引起的幀內(nèi)模糊。此外，我們在實驗之前預(yù)先訓練動物適應(yīng)安裝在其頭骨上的微型顯微鏡，并滴加1.5%低熔點瓊脂糖使其充滿物鏡和腦組織之間，這些措施都顯著降低了探頭與大腦之間的相對運動，進而改善了實驗短期和長期的穩(wěn)定性，于是實現(xiàn)了在動物進行包含大量身體和頭部運動的行為學試驗中中進行高分辨率成像。

圖4 FIRM-TPM實物圖，來自12

　　樹突棘活動是神經(jīng)元信息處理的基本事件，利用臺式雙光子顯微鏡在頭固定的動物上的研究表明單個神經(jīng)細胞的不同樹突棘可以被不同朝向的視覺刺激或不同強度頻率的聲音刺激所激活。FHIRM-TPM實現(xiàn)了與傳統(tǒng)的大型的臺式雙光子顯微鏡相同的分辨率和光學層切能力。與微型寬場顯微鏡相比，F(xiàn)IRM-TPM的高空間分辨率，固有的光學切片能力和組織穿透能力以及相當?shù)臋C械穩(wěn)定性都是極有優(yōu)勢的。所以雖然通過微型寬場顯微鏡可以獲得數(shù)百個神經(jīng)元在細胞水平上的活動，但是我們的 FHIRM-TPM無疑提供了一個更加強大的工具，即在自由活動的動物中對更加基本的神經(jīng)編碼單位——樹突棘的時空特性進行觀測。它能夠在對小鼠依次進行的行為學試驗(例如懸尾，跳臺，以及社交行為)的過程中長時間觀察位大腦中的神經(jīng)元胞體、樹突和樹突棘的活動。這些功能的展示充分證明了FHIRM-TPM具有良好的性能和穩(wěn)定性。未來，與光遺傳學技術(shù)的結(jié)合，可望在結(jié)構(gòu)與功能成像的同時，精準地操控神經(jīng)元和大腦神經(jīng)回路的活動。微型雙光子熒光顯微鏡整機性能十分穩(wěn)定，可用于在動物覓食、跳臺、打斗、嬉戲、睡眠等自然行為條件下，或者在學習前、學習中和學習后，長時程觀察神經(jīng)突觸、神經(jīng)元、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、遠程連接的腦區(qū)等多尺度、多層次動態(tài)變化。

圖5 三種模式在結(jié)構(gòu)學成像中的成像質(zhì)量對比，來自12

圖6 FHIRM-TPM在三種不同的行為學范例對小鼠大腦皮層神經(jīng)元活動進行成像，來自12

　　從2001年Denk發(fā)表第一篇微型雙光子顯微鏡的原型機以來，微型雙光子顯微鏡的發(fā)展已經(jīng)走過了15年的時間。15年的發(fā)展歷程，微型雙光子顯微鏡從最開始的25克笨重的身軀，只能在分離的組織中進行驗證性的實驗8到如今重量僅兩點幾克重，可以對自由活動的小鼠神經(jīng)元進行樹突棘級別的成像，可以說取得了一定的進步。然而，在看到這個領(lǐng)域取得的成就的同時，也應(yīng)看到，至今為止，微型雙光子顯微鏡還未像共聚焦顯微鏡或者是熒光光片顯微鏡一樣被生物學家廣泛認可和應(yīng)用。而后者(光片顯微鏡)的發(fā)展時間更短(2008年Science的一篇文獻一般被認為是現(xiàn)代熒光光片顯微鏡鏡的開端13)。究其原因，除了技術(shù)本身的限制以外，整個研究領(lǐng)域的氣氛和投入，也是重要的影響因素之一。

　　縱觀這15年來微型雙光子顯微鏡的發(fā)展道路，開疆拓土者有之;改革創(chuàng)新者有之;另辟蹊徑者有之;渾水摸魚、指鹿為馬者亦有之。然而遺憾的是，愿意心無旁騖、全情投入者鮮有之;有意愿和能力建立為這個研究的領(lǐng)域建立范式者亦鮮有之。而中國，在不久前在這個領(lǐng)域基本上屬于完全的空白。更不要說什么領(lǐng)先世界。

　　然而令人十分興奮的是，中國國家基金委國家重大科研儀器設(shè)備研制專項在2014年正式將“超高時空分辨微型雙光子在體顯微成像系統(tǒng)”立項。以5年七千兩百萬人民幣的研究經(jīng)費對這一項“世界上做的還并不怎么好，中國基本沒人做過”的技術(shù)進行攻關(guān)研發(fā)。這樣的大力投入無疑為這一領(lǐng)域注入了新鮮血液和十足動力。而我也有幸在博士五年期間全程參與了這個項目的工作。從2012年來到該項目首席負責人程和平院士和陳良怡研究員的聯(lián)合課題組至今，我見證了這個項目從無到有，團隊從幼小稚嫩到壯大成熟的整個過程。如今，我們有了初步的成果，不僅讓我們這樣一支完全由中國本國科研工作者建立的團隊在世界上處在了較為領(lǐng)先的位置，同時也把這個領(lǐng)域向前推動了一些，我感到無比激動和自豪。

　　該成果在2016年底美國神經(jīng)科學年會、2017年5月冷泉港亞洲腦科學專題會議上報告后，得到包括多位諾貝爾獎獲得者在內(nèi)的國內(nèi)外神經(jīng)科學家的高度贊譽。冷泉港亞洲腦科學專題會議主席、美國著名神經(jīng)科學家加州大學洛杉磯分校的Alcino J Silva教授在評述中寫道，“從任何一個標準來看，這款顯微鏡都代表了一項重大技術(shù)發(fā)明，必將改變我們在自由活動動物中觀察細胞和亞細胞結(jié)構(gòu)的方式。它所開啟的大門，甚至超越了神經(jīng)元和樹突成像。系統(tǒng)神經(jīng)生物學正在進入一個新的時代，即通過對細胞群體中可辨識的細胞和亞細胞結(jié)構(gòu)的復雜生物學事件進行成像觀測，從而更加深刻地理解進化所造就的大腦環(huán)路實現(xiàn)復雜行為的核心工程學原理。毫無疑問，這項非凡的發(fā)明讓我們向著這一目標邁進了一步?！?p>　　1. Denk, W., Strickler, J. & Webb, W.Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science248, 73-76(1990).

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