在一項(xiàng)新的研究中，首次開發(fā)出了一種快速而又廉價的高度靈敏的基于CRISPR的診斷工具---SHERLOCK(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)。研究人員極大地增強(qiáng)了這種工具的功能，并且開發(fā)出一種微型試紙條測試方法，這種測試方法允許用肉眼觀察到測試結(jié)果，而無需使用昂貴的設(shè)備。相關(guān)研究結(jié)果于2018年2月15日在線發(fā)表在Science期刊上，論文標(biāo)題為“Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6”。

圖片來自Zhang lab, Broad Institute。

　　這些研究人員開發(fā)出一種簡單的試紙條用于顯示單個遺傳標(biāo)記的測試結(jié)果，就好比于妊娠試驗(yàn)中常見的視覺線索。在將試紙條浸入經(jīng)過處理的樣品中后，就會出現(xiàn)一條線來指示靶分子是否被檢測到。

　　這種新的特征有助于為現(xiàn)場測試(比如在流行病爆發(fā)期間)鋪平道路。這些研究人員還增加了SHERLOCK的靈敏度，并增加準(zhǔn)確地定量確定樣品中的靶分子水平和一次測試多種靶分子的能力?？傊@些進(jìn)展加快SHERLOCK快速和精確地檢測樣本中的遺傳特征(包括病原體和腫瘤DNA)的能力。

　　正如這項(xiàng)新的研究所描述的那樣，這些新的進(jìn)展建立在這些研究人員開發(fā)的SHERLOCK早期版本之上，并且有越來越多的研究領(lǐng)域?qū)RISPR系統(tǒng)用于基因編輯之外的用途。這項(xiàng)新的研究是由麻省理工學(xué)院、哈佛大學(xué)和布羅德研究所的研究人員領(lǐng)導(dǎo)的，有潛力對研究和全球公共健康產(chǎn)生變革性的影響。

　　論文通信作者、布羅德研究所核心成員Feng Zhang 教授說，“SHERLOCK提供一種廉價的、易于使用的和靈敏的診斷方法來檢測核酸物質(zhì)---這能夠意味著病毒、腫瘤DNA和很多其他的靶標(biāo)。如今，對SHERLOCK的改進(jìn)給我們提供了更多的診斷信息，并且讓我們更接近于提供一種在實(shí)際應(yīng)用中進(jìn)行部署的工具。”

　　這些研究人員之前展示了SHERLOCK在各種應(yīng)用中的實(shí)用性。在這項(xiàng)新的研究中，他們利用SHERLOCK檢測肺癌患者血液樣本中的無細(xì)胞腫瘤DNA，同時檢測人工合成的寨卡病毒和登革熱病毒，以及提供其他的展示。

　　試紙條上的明確結(jié)果

　　論文共同第一作者、Zhang實(shí)驗(yàn)室研究生Jonathan Gootenberg說，“這種新的采用了SHERLOCK技術(shù)的試紙條測試結(jié)果讓你觀察到你的靶標(biāo)是否存在于樣品中，而無需使用儀器。這讓我們更接近于現(xiàn)場診斷。”

　　這些研究人員設(shè)想SHERLOCK具有廣泛的用途，這要?dú)w功于它在核酸靶標(biāo)檢測方面的多功能性。Zhang補(bǔ)充道，“這種技術(shù)展示了它在許多醫(yī)療保健應(yīng)用中的潛力，包括診斷患者體內(nèi)的感染和檢測賦予耐藥性或?qū)е掳┌Y的突變，不過它也能夠用于工業(yè)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用中，在這些應(yīng)用中，供應(yīng)鏈中的監(jiān)控步驟能夠減少浪費(fèi)和提高安全性?！?p>　　基本原理

　　SHERLOCK取得成功的關(guān)鍵在于一種被稱作Cas13的CRISPR相關(guān)蛋白，這種蛋白經(jīng)編程后結(jié)合到一段特定的RNA片段上。Cas13的靶標(biāo)能夠是任何基因序列，包括病毒基因組、在細(xì)菌中賦予抗生素耐藥性的基因或者導(dǎo)致癌癥的突變。在某些情況下，一旦Cas13定位到并切割它指定的靶標(biāo)，這種酶就會超速運(yùn)轉(zhuǎn)，從而不加區(qū)別地切割附近的其他RNA。為了開發(fā)出SHERLOCK，這些研究人員將這種“脫靶”活性轉(zhuǎn)化為它的優(yōu)勢，從而設(shè)計(jì)出這種與DNA和RNA相兼容的系統(tǒng)。

　　SHERLOCK的診斷潛力依賴于額外的在遭受切割后產(chǎn)生信號的合成RNA鏈。在Cas13結(jié)合到它的初始靶標(biāo)后，它會切割這種合成RNA，釋放出信號分子，從而產(chǎn)生指示它的靶標(biāo)存在或不存在的測量值。

　　檢測多種靶標(biāo)

　　SHERLOCK平臺如今能夠適用于測試多種靶標(biāo)。SHERLOCK最初一次只能檢測到一種核酸序列，但是如今一次分析能夠同時為多達(dá)4種不同的靶標(biāo)提供熒光信號---這意味著需要更少的樣品用于診斷中。比如，這種新的SHERLOCK版本能夠在單一反應(yīng)中確定一種樣品是否含有寨卡病毒或登革熱病毒顆粒，這些病毒顆粒會導(dǎo)致患者出現(xiàn)類似的癥狀。這種平臺利用來自不同細(xì)菌種類的Cas13和Cas12a(以前稱為Cpf1)酶產(chǎn)生這些額外的信號。

　　增加的靈敏度

　　SHERLOCK的第二次迭代也使用了一種額外的CRISPR相關(guān)酶(即Csm6)來放大它的檢測信號，從而使得這種工具比它的前身具有更高的靈敏度。論文共同第一作者、Zhang實(shí)驗(yàn)室的麻省理工學(xué)院研究生Omar Abudayyeh解釋道，“利用最初的SHERLOCK，我們能夠檢測到1微升樣品中的單個分子，但如今我們能夠讓這種靈敏度增加100倍。這對檢測血液樣品中無細(xì)胞腫瘤DNA之類的應(yīng)用是特別重要的，在這些應(yīng)用中，靶標(biāo)分子的濃度可能是非常低的。這種新一代的特性有助于讓SHERLOCK成為一種更加精確的系統(tǒng)。”

　　參考資料：

　　Jonathan S. Gootenberg, Omar O. Abudayyeh, Max J. Kellner et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science, Published online: 15 Feb 2018, doi:10.1126/science.aaq0179