衛(wèi)生部臨檢中心組織的2018年第一次臨床微生物室間質(zhì)評(píng)已經(jīng)結(jié)束，但關(guān)于流感嗜血桿菌和溶血嗜血桿菌的鑒定問題，在微信朋友圈里談得正熱烈 (見文《溶血 or 流感?傻傻分不清?》)[1]。主要是因?yàn)樵谶@次質(zhì)評(píng)中，生化鑒定儀和有些品牌的質(zhì)譜儀的鑒定結(jié)果出錯(cuò)了。令小布自豪的是，布魯克MALDI Biotyper質(zhì)譜的鑒定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)答案完全相符!所以小布在這里來一段點(diǎn)評(píng)。

　　流感嗜血桿菌和溶血嗜血桿菌雖然同屬，但屬于兩個(gè)不同的種，致病性和臨床意義也大不相同，前者是上呼吸道感染的常見致病菌，而后者是上呼吸道的正常定植菌。小布認(rèn)為要認(rèn)真、仔細(xì)地把它們區(qū)分開，千萬不要混淆!

　　可是這兩種菌的親緣關(guān)系很近，用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生化方法難以區(qū)分。雖然產(chǎn)莢膜的流感嗜血桿菌可以通過莢膜腫脹實(shí)驗(yàn)區(qū)別于溶血嗜血桿菌，但有些流感嗜血桿菌是不產(chǎn)莢膜的，通常被認(rèn)為是無法分型的。同樣，雖然有的溶血嗜血桿菌能夠通過衛(wèi)星試驗(yàn)觀察到溶血環(huán)，但不是所有的溶血嗜血桿菌都能觀察到明顯的溶血環(huán)。

　　難道就沒有好辦法了嗎?當(dāng)然不是!

　　質(zhì)譜是區(qū)分流感嗜血桿菌和溶血嗜血桿菌的好方法

　　早在2013年中國(guó)CDC的研究人員就通過質(zhì)譜圖的聚類分析，發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜可以把流感嗜血桿菌和溶血嗜血桿菌清楚地分成兩類，甚至可以把不同地區(qū)來源的菌株進(jìn)一步細(xì)分(見圖1)[2]。

　　▲圖1. 流感嗜血桿菌和溶血嗜血桿菌的聚類分析樹狀圖(MALDI Biotyper結(jié)果)

　　2014年荷蘭公共衛(wèi)生區(qū)域?qū)嶒?yàn)室、荷蘭醫(yī)學(xué)中心與布魯克微生物研發(fā)中心共同發(fā)表了MALDI Biotyper能夠正確鑒定流感嗜血桿菌和溶血嗜血桿菌的文章 [2]，專家們通過分析不同來源的277個(gè)菌株，發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜法與測(cè)序法鑒定流感嗜血桿菌和溶血嗜血桿菌的結(jié)果幾乎完全一致(見表1)。

　　▼表1.流感嗜血桿菌和溶血嗜血桿菌的MALDI Biotyper質(zhì)譜法與測(cè)序法鑒定結(jié)果比較

　　另外，布魯克公司在美國(guó)FDA注冊(cè)進(jìn)行臨床試驗(yàn)的結(jié)果顯示：通過對(duì)74個(gè)流感嗜血桿菌和31個(gè)溶血嗜血桿菌的檢測(cè)MALDI Biotyper質(zhì)譜法鑒定100%正確!(結(jié)果摘自布魯克公司提交美國(guó)FDA的報(bào)告)

　　可見，質(zhì)譜是區(qū)分流感嗜血桿菌和溶血嗜血桿菌可以信賴的方法!有些老師不免心生疑問：既然布魯克質(zhì)譜的鑒定結(jié)果都是正確的，那為什么其它品牌的質(zhì)譜鑒定錯(cuò)了呢?

　　質(zhì)譜法的數(shù)據(jù)庫(kù)和鑒定結(jié)果的算法非常重要

　　原來呀，質(zhì)譜鑒定微生物時(shí)，需要通過軟件拿采集到的樣品“蛋白指紋圖”到數(shù)據(jù)庫(kù)里進(jìn)行逐個(gè)比對(duì)，因此，數(shù)據(jù)庫(kù)建立與比對(duì)時(shí)所采用的理念與算法，以及數(shù)據(jù)庫(kù)的容量，是影響鑒定結(jié)果非常重要的因素。

　　布魯克MALDI Biotyper的建庫(kù)理念是以菌株為單位，數(shù)據(jù)庫(kù)中每個(gè)條目都是一個(gè)獨(dú)立的菌株。它的比對(duì)算法是采用指紋識(shí)別中的“模式識(shí)別”算法，就是把樣品的“蛋白指紋圖”與數(shù)據(jù)庫(kù)中所有菌株的“蛋白指紋圖”快速自動(dòng)地進(jìn)行逐個(gè)圖逐個(gè)峰的比較，看看每對(duì)比對(duì)的“蛋白指紋圖”之間有哪些峰是匹配的，哪些峰是不匹配的，以及匹配的譜峰之間相對(duì)強(qiáng)度的相關(guān)性，從而得到一個(gè)綜合的匹配分?jǐn)?shù)，并根據(jù)分?jǐn)?shù)值告訴我們鑒定的可信程度。

　　MALDI Biotyper的算法看上去通俗、簡(jiǎn)單，正可謂“大道至簡(jiǎn)”吧，不僅非常實(shí)用!而且最大程度上避免了誤判!就像警察通過指紋比對(duì)來識(shí)別罪犯一樣，只要數(shù)據(jù)庫(kù)里有罪犯的指紋，它就能正確地識(shí)別出罪犯;即使數(shù)據(jù)庫(kù)里沒有罪犯的指紋，它也不會(huì)找錯(cuò)，只是告訴我們當(dāng)前數(shù)據(jù)庫(kù)里沒有匹配的指紋，只要擴(kuò)大搜索數(shù)據(jù)庫(kù)的范圍，定會(huì)讓罪犯無以循形，不會(huì)造成冤假錯(cuò)案!

　　有些老師可能會(huì)問：我們是做菌種鑒定，MALDI Biotyper的數(shù)據(jù)庫(kù)為什么不以菌種為單位，而是以菌株為單位建立的呢?難道它能鑒定到菌株嗎?

　　大家知道，微生物種類繁多，每種微生物又包含豐富多樣的不同菌株，而同一菌種內(nèi)不同菌株之間的差異是天然存在的，并和微生物的種類有關(guān)，有的種內(nèi)差異大，有的種內(nèi)差異小。所以，布魯克決定在菌株水平上建庫(kù)，并在選擇每個(gè)菌種的建庫(kù)菌株時(shí)，盡可能包含差異大的菌株，而剔除差異小的菌株。MALDI Biotyper在菌株水平建庫(kù)，具有以下優(yōu)勢(shì)：

　　給代表性菌株預(yù)留了充分的覆蓋范圍

　　避免了數(shù)據(jù)庫(kù)不必要的冗余

　　容易實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)的擴(kuò)充和更新

　　能快速適應(yīng)分類學(xué)的改變

　　充分發(fā)揮了質(zhì)譜技術(shù)分辨能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)方法(如生化方法)的特點(diǎn)，不丟失種水平之內(nèi)菌株之間的差異。

　　正是由于上述優(yōu)勢(shì)，美國(guó)CDC、加拿大國(guó)家微生物實(shí)驗(yàn)室和美國(guó)NIH等多家機(jī)構(gòu)也在采用布魯克的儀器和理念建立數(shù)據(jù)庫(kù)并對(duì)外開放。

　　通過以上對(duì)布魯克MALDI Biotyper質(zhì)譜的數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件算法的簡(jiǎn)單介紹，相信各位老師就能理解為什么這次衛(wèi)生部的質(zhì)評(píng)中，布魯克質(zhì)譜的鑒定結(jié)果是正確的，也就很好理解為什么美國(guó)FDA批準(zhǔn)Bruker MALDI Biotyper CA系統(tǒng)作為首個(gè)鑒定新型致病菌耳念珠菌(C. auris) 的新方法了[4-6]。

　　參考文獻(xiàn)

　　1. 溶血 or 流感?傻傻分不清?

　　2. B. Q. Zhu, D Xiao et al. MALDI-TOF MS Distinctly Differentiates Nontypable Haemophilus influenzae from Haemophilus haemolyticus.PLoS One. 2013; 8(2): e56139

　　3. J. P. Bruin, M. Kostrzewa et al. Identification of Haemophilus influenzae and Haemophilus haemolyticus by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2014, 33:279–284

　　4. 　　5. FDA首次批準(zhǔn)質(zhì)譜方法鑒定新型致病菌耳念珠菌 (Candida auris)

　　6. “布”下天羅地網(wǎng)，防止“耳念”侵襲