摘 要：隨著抗體藥物上游大規(guī)模高效培養(yǎng)技術(shù)的飛速發(fā)展，抗體蛋白的表達(dá)濃度有了大幅度的提高，這給下游純化工藝帶來了巨大的壓力。為了突破下游技術(shù)瓶頸，整個(gè)世界生物制藥產(chǎn)業(yè)都加大了對(duì)下游技術(shù)的革新力度，近年來也取得了豐碩的成果。本文就抗體藥物的純化策略、最新技術(shù)進(jìn)展以及技術(shù)應(yīng)用等方面做一個(gè)調(diào)研，以期能對(duì)本部門的相關(guān)研究工作有所助益。

　　關(guān)鍵詞：抗體 下游工藝 純化 技術(shù)進(jìn)展

　　自1997年來，全球抗體藥物市場(chǎng)經(jīng)歷了一個(gè)快速發(fā)展的階段，總銷售額從1997年的3.1億美元增長(zhǎng)到2008年的400億美元，復(fù)合增長(zhǎng)率高達(dá)55%，而且增長(zhǎng)勢(shì)頭還在持續(xù) [1]。國(guó)際上通常把年銷售額超過10 億美元的品牌藥稱為“重磅炸彈”藥物，很大一部分抗體藥物都已邁入“重磅炸彈”行列。在2008年全球15大藥品中，抗體藥物占據(jù)了1/3，且排名仍在上升，這意味著幾乎每種單抗藥物的成功開發(fā)都代表著巨大的市場(chǎng)前景[2]。受益于此，全球主要的生物制藥公司都獲利頗豐，可見抗體藥物具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。

　　抗體藥物生產(chǎn)技術(shù)門檻高，需要掌握抗體篩選、抗體重組、高表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建和大規(guī)模懸浮培養(yǎng)等核心技術(shù)，其下游關(guān)鍵技術(shù)是長(zhǎng)期以來的薄弱之處。哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有活性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為抗體等生物制品最重要的系統(tǒng)之一，為抗體藥物的產(chǎn)業(yè)化提供可能。目前，國(guó)際上該項(xiàng)技術(shù)發(fā)展較快，已趨成熟，以默克公司為代表的流加培養(yǎng)生產(chǎn)規(guī)模達(dá)10000L以上，以貝爾公司為代表的灌流培養(yǎng)生產(chǎn)規(guī)模達(dá)200L以上，蛋白表達(dá)濃度為1-10g/L。我國(guó)在該技術(shù)領(lǐng)域起步較晚，基礎(chǔ)較差，但近年來經(jīng)過努力，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了該項(xiàng)技術(shù)的突破，流加培養(yǎng)規(guī)模達(dá)500L以上，灌流培養(yǎng)規(guī)模達(dá)100L以上，蛋白表達(dá)濃度為0.2-2g/L[2]。

　　隨著動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)抗體產(chǎn)品大規(guī)模高效培養(yǎng)技術(shù)的快速發(fā)展，下游純化工藝越來越成為抗體藥物生產(chǎn)中主要的技術(shù)瓶頸[3]。因此，如何提高下游工藝的生產(chǎn)效率就成為了抗體藥物研發(fā)必須解決的問題。本文就國(guó)際上高表達(dá)抗體蛋白下游工藝的研究進(jìn)展做一個(gè)調(diào)研，使本人及同事們能了解國(guó)際上的研究成果和發(fā)展趨勢(shì)，以期能對(duì)本部門的相關(guān)研究工作有所助益。

　　1. 抗體藥物純化策略

　　每個(gè)單抗的等電點(diǎn)、電荷密度、疏水性、糖基化程度等生化性質(zhì)各不相同。選擇單抗的純化方法，既要了解它們的共性，又要了解它們的個(gè)性，從而制定相應(yīng)的純化策略(表1)。

　　1.1 抗體藥物下游工藝一般策略

　　CHO和NSO等哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)主要用來生產(chǎn)治療性單抗，臨床劑量大(數(shù)十至幾百毫克/dose)，批產(chǎn)量達(dá)公斤級(jí)，純度要求極高。層析技術(shù)是抗體分離純化的核心技術(shù)，一般采用經(jīng)典的三步純化策略：粗純-中間純化-精細(xì)純化。粗純的主要目的是捕獲、濃縮和穩(wěn)定樣品，約80%的下游工藝用Protein A親和層析進(jìn)行快速捕獲，一步即可達(dá)到95%以上的純度。治療用抗體一般使用動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模高密度無血清懸浮培養(yǎng)進(jìn)行生產(chǎn)，不僅對(duì)終產(chǎn)品的單體含量有嚴(yán)格的規(guī)定，還必須去除各種潛在的雜質(zhì)以滿足藥品安全的要求，因此在粗純之后還需要進(jìn)行中間純化和精細(xì)純化，去除宿主細(xì)胞蛋白(HCP)、宿主DNA、抗體聚集體和變體等，常用的層析技術(shù)有離子交換、凝膠過濾、疏水層析等[4]。

　　2003 年初，中國(guó)SFDA下屬的中國(guó)藥品與生物制品檢定所(NICPBP)公布了《人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》[5]。生產(chǎn)者除須保證最終抗體產(chǎn)品純度，還需要驗(yàn)證所用的純化方法能有效對(duì)潛在的污染物，如HCP、免疫球蛋白、宿主DNA、用于生產(chǎn)腹水抗體的刺激物、內(nèi)毒素、培養(yǎng)液成分、層析凝膠析出成分(脫落的Protein A配基)進(jìn)行去除;并能有效的去除/滅活病毒。也就是說，在設(shè)計(jì)下游工藝時(shí)，需多角度綜合考慮抗體本身的性質(zhì)、抗體的來源、發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)、發(fā)酵液蛋白濃度、宿主雜質(zhì)、抗體批間的差異、潛在污染及病毒滅活等問題。此外，治療用抗體在生產(chǎn)和純化過程中還會(huì)由于糖基化程度不同、蛋白酶作用、以及脫氨基和脫酰胺等反應(yīng)而產(chǎn)生帶電性質(zhì)不同的多種抗體變體;另外，抗體氧化、聚集和片段化也是常見的降解途徑[4]。針對(duì)這些變體，一方面，在表達(dá)和純化過程中選擇參數(shù)(如pH、鹽濃度等)時(shí)要充分考慮到目標(biāo)抗體的穩(wěn)定性;另一方面，應(yīng)控制細(xì)胞培養(yǎng)的條件(DO、滲透壓等)，同時(shí)加快下游分離純化的速度，最大程度上避免抗體在純化過程中產(chǎn)生變體，從而保證終產(chǎn)品的均一性和高的比活，也有利于控制終產(chǎn)品的內(nèi)毒素水平。

　　表1 單抗特性及純化策略

　　1.2 新型的兩步層析技術(shù)與純化工藝整合

　　近年來，GE Healthcare公司開發(fā)出了新型的親和捕獲介質(zhì)Mabselect SuRe和混合作用模式的強(qiáng)陰離子交換介質(zhì)Capto adhere(這兩種介質(zhì)的主要特點(diǎn)將在下文詳細(xì)介紹)。憑借著MabSelect SuRe的卓越性能以及Capto adhere的復(fù)合多除雜功能，使得抗體純化工藝由經(jīng)典的三步層析轉(zhuǎn)變?yōu)閮刹綄游龅靡詫?shí)現(xiàn)。這種新型的兩步層析技術(shù)的工藝流程是：在細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)以后，采用0.2-0.45μm的中空纖維膜技術(shù)進(jìn)行澄清，然后用MabSelect SuRe捕獲，酸性條件洗脫后直接pH 4.0 病毒滅活，澄清過濾后穿透方式上Capto adhere，這一步離子交換之前或之后會(huì)有一步20nm納濾去病毒，最后50K膜超濾濃縮和洗濾進(jìn)行緩沖液置換。整個(gè)工藝如圖1,這一工藝平臺(tái)已經(jīng)嘗試過多個(gè)不同的抗體并取得成功(表2),同時(shí)很多實(shí)驗(yàn)表明這一工藝平臺(tái)適合多數(shù)抗體的生產(chǎn)。有些抗體如果通過優(yōu)化結(jié)果不甚滿意, 通過增加一步Capto Q也基本上可以達(dá)到要求或是采用Capto S-Capto Q(這兩種介質(zhì)的主要特點(diǎn)將在下文詳細(xì)介紹)的工藝步驟[4]。

　圖1　抗體生產(chǎn)兩步層析法主導(dǎo)的抗體純化最新工藝[6]

　　Mabselect SuRe可以達(dá)到99%以上的抗體純度，親和洗脫峰使用Capto adhere的流穿模式進(jìn)行精純：使抗體分子流穿而聚合體、HCP、脫落的Protein A配基等雜質(zhì)結(jié)合在柱上加以去除。這樣僅用兩步層析就可以得到符合藥用級(jí)質(zhì)量要求的高純度抗體產(chǎn)品，大大縮短了工藝時(shí)間，提高了生產(chǎn)效率，同時(shí)增加了收率，降低了生產(chǎn)成本。

　　表2 兩步法用于多種抗體的純化結(jié)果(括號(hào)內(nèi)數(shù)值為純化前)[4]

　　2. 抗體藥物下游技術(shù)最新研究進(jìn)展

　　2.1 樣品澄清

　　2.1.1 中空纖維膜過濾技術(shù)

　　中空纖維膜是近年來發(fā)展起來的新型切向流膜分離技術(shù),與盒式膜包相比,中空纖維膜可以直接處理高固含量和高黏度的粗料液,具有容塵量高、速度快、剪切力小、成本低等優(yōu)點(diǎn)。目前,中空纖維微濾膜已經(jīng)廣泛用于生物制藥的各個(gè)領(lǐng)域[7]。

　　對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液,可以將高密度的培養(yǎng)液直接用中空纖維微濾膜(0.22或0.45μm)進(jìn)行澄清,而無需事先經(jīng)過離心和預(yù)過濾,步驟少,速度快,收率高,成本低。和離心機(jī)比較,具有極高的澄清度,因此中空纖維澄清后的細(xì)胞培養(yǎng)液可直接Protein A親和層析進(jìn)行純化。

　　中空纖維膜澄清細(xì)胞培養(yǎng)液的優(yōu)勢(shì)有：(1)步驟少,速度快,收率更高(通過有效的洗濾可使樣品收率穩(wěn)定而且高于離心機(jī))，同時(shí)最大程度上避免抗體降解而影響產(chǎn)品均一性。(2)成本低：不僅省去了連續(xù)流高速離心機(jī)昂貴的前期投資和運(yùn)轉(zhuǎn)的日常維護(hù)成本，還節(jié)省了離心后死端過濾的成本。中空纖維膜物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可以通過清洗而反復(fù)使用，成本低廉。(3)有利于內(nèi)毒素控制：中空纖維膜穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)可以耐受1M NaOH 40-50℃和氧化劑NaClO的清洗，從而有效去除內(nèi)毒素;封閉的系統(tǒng)，也更有利于生產(chǎn)過程中內(nèi)毒素的控制。此外，大部分中空纖維濾柱還可以進(jìn)行高壓滅菌。(4)低剪切力：中空纖維采用低剪切力的開放式流道，不僅可以處理含有高固含量的料液，還避免了蛋白質(zhì)活性分子在高剪切力下的聚集變性，有利于抗體的穩(wěn)定。(5)工藝耐用性強(qiáng)：相比死端過濾，中空纖維澄清具有很好的操作靈活性和耐用性，可以通過調(diào)整操作參數(shù)(流速、TMP)處理不同性質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)液。(6)易于線性放大：通過維持切向流速、TMP 等參數(shù)恒定，方便地進(jìn)行線性放大，生產(chǎn)規(guī)模的處理量可達(dá)幾千升料液，目前國(guó)內(nèi)銷售最大的中空纖維膜過濾系統(tǒng)已達(dá)400m2且生產(chǎn)穩(wěn)定[8]。

　　2.1.2 深層過濾介質(zhì)

　　深層過濾采用兩種機(jī)制去除顆粒。首先是攔截，顆粒由于自身的物理尺寸在過濾器內(nèi)被截留。它們可能被困在過濾器表面，因此根本沒有進(jìn)入基質(zhì)，或在通過深層過濾基質(zhì)的曲徑時(shí)被俘獲(篩選)。顆粒攔截伴隨過濾器壓差增高，因?yàn)樗幕|(zhì)被不斷累積的顆粒堵塞。第二種機(jī)制是吸附，比過濾器攔截精度更小的顆粒能夠從流體中被吸附去除。這種機(jī)制是通過深層過濾基質(zhì)上的凈電荷實(shí)現(xiàn)的[26]。

　　目前應(yīng)用比較廣泛的雙層膜深層過濾介質(zhì)有Millipore公司的Millistak+HC、Sartorius公司的Sartobran-P、Pall公司的Supradisc HP等。Millistak+HC深層過濾介質(zhì)由纖維素和無機(jī)助濾劑(聚丙稀粘合的硅藻土)組成，包裹在聚丙烯外殼內(nèi);它由兩層全厚度深層濾板(上游一層粗過濾和下游一層精細(xì)過濾)組成，附帶一層RW01纖維素膜終過濾。Sartobran-P深層過濾介質(zhì)由醋酸纖維素濾膜、聚丙烯外殼和支撐層組成，加強(qiáng)型的濾膜有良好的機(jī)械強(qiáng)度，有利于在反復(fù)的過濾和滅菌過程中保持完好無損;采用了折疊膜，在體積小巧的同時(shí)還保證了超大的過濾面積。Supradisc HP深層過濾介質(zhì)由纖維素、硅藻土、帶正電荷樹脂和聚丙烯組成;也由兩層全厚度深層濾板(上游一層粗過濾和下游一層精細(xì)過濾)組成。

　　2.2最新抗體捕獲技術(shù)

　　2.2.1 MabSelect介質(zhì)

　　MabSelect是第一個(gè)使用高流速瓊脂糖凝膠作為骨架的新型Protein A層析介質(zhì)，專為大規(guī)?？贵w純化而設(shè)計(jì)，適合快速高效的進(jìn)行抗體生產(chǎn)和放大，已經(jīng)成為單抗純化和放大的標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)。

　　MabSelect的特點(diǎn)有：(1)更高的流速和動(dòng)態(tài)載量：Protein A經(jīng)基因工程改造，C端含一個(gè)半胱氨酸，形成一個(gè)定向的硫酯鍵，同時(shí)增加了對(duì)IgG的有效結(jié)合。Protein A和凝膠偶聯(lián)時(shí)采用了全新的單點(diǎn)偶聯(lián)工藝，降低了空間位阻，因此可以在使用更高流速的條件下增加動(dòng)態(tài)載量：在線形流速為500cm/hr和柱床高度為20cm(停留時(shí)間2.4min)的條件下，每毫升MabSelect的動(dòng)態(tài)載量可以達(dá)到>30mg IgG。(2)更低的非特異性吸附，抗體純度更高：Mabselect介質(zhì)高度親水性的瓊脂糖骨架最大程度上降低了非特異性吸附，使得洗脫峰中雜蛋白和DNA更少，有利于后期抗體的精細(xì)純化。著名的抗體生產(chǎn)商IDEC公司以及R.Hahn的研究顯示，Mabselect對(duì)CHO細(xì)胞HCP的吸附比其它Protein A介質(zhì)低7倍[9-10]。R.L.Fahrner等的研究顯示，Mabselect所得抗體的DNA殘留量比其它Protein A介質(zhì)低30%[11]。(3)更低的Protein A脫落：MabSelect由于通過新型環(huán)氧共價(jià)交聯(lián)技術(shù)，Protein A的脫落比其它同類介質(zhì)低，這不僅有利于抗體純化，還延長(zhǎng)了介質(zhì)的使用壽命，降低了生產(chǎn)成本。(4)更易于工藝的線性放大：通過實(shí)驗(yàn)室條件的優(yōu)化，MabSelect 可以在保持線性流速和上樣比例等參數(shù)不變的條件下，通過增加柱直徑進(jìn)行線性放大。(5)MabSelect 易于清洗與除菌，壽命更長(zhǎng)、更經(jīng)濟(jì)：在長(zhǎng)期連續(xù)的生產(chǎn)中，有效的在位清洗(CIP)有助于延長(zhǎng)介質(zhì)使用壽命，但一般的Protein A介質(zhì)往往不能耐受NaOH，只能使用高濃度的尿素或鹽酸胍進(jìn)行清洗，效果遠(yuǎn)不如NaOH且成本非常高。而MabSelect的CIP和除菌程序簡(jiǎn)單，用很常規(guī)、經(jīng)濟(jì)的試劑如50mM NaOH+1M NaCl或50mM NaOH+0.5M Na2SO4就可以有效去除沉淀和變性物質(zhì);用非離子去污劑或酒精可以去除通過疏水作用結(jié)合的物質(zhì);用0.1M醋酸和20%酒精可以在位滅菌(SIP)。經(jīng)測(cè)試，Mabselect配合CIP(50mMNaOH+1M NaCl)純化三百次后，抗體產(chǎn)品純度與收率不變[12]。

　　2.2.2 MabSelect Xtra介質(zhì)

　　Mabselect Xtra介質(zhì)是在Mabselect介質(zhì)的基礎(chǔ)上優(yōu)化而來，是目前市場(chǎng)上所有的商品化Protein A介質(zhì)中載量最高的親和層析介質(zhì)之一。它除了具有MabSelect介質(zhì)的全部特點(diǎn)外，還具有載量最高和非特異性吸附更低的特點(diǎn)。

　　Mabselect Xtra介質(zhì)使用孔徑更大的多孔高流速瓊脂糖作為骨架，同時(shí)減小介質(zhì)粒徑。這樣不僅增加了比表面積和配基密度，還降低了傳質(zhì)阻力，從而有效的增加了動(dòng)態(tài)載量。其動(dòng)態(tài)載量超過41mg/ml，在工藝生產(chǎn)過程中可以有效減少層析柱的體積，從而降低生產(chǎn)成本。R.Hahn的研究顯示，Mabselect Xtra對(duì)CHO細(xì)胞HCP的吸附比其它Protein A介質(zhì)更是低了近10倍[13]。

　　2.2.3 MabSelect SuRe介質(zhì)

　　MabSelect SuRe介質(zhì)也是在Mabselect介質(zhì)的基礎(chǔ)上優(yōu)化而來，是目前市場(chǎng)上唯一耐強(qiáng)堿的Protein A親和層析介質(zhì)，壽命最長(zhǎng)，穩(wěn)定性最好[10]。它除了具有MabSelect介質(zhì)的全部特點(diǎn)外，還具有以下特點(diǎn)：(1)可以耐受0.1-0.5M NaOH：MabSelectSuRe具有不同于其它Protein A介質(zhì)的同型四聚體配基-SuRe配基，即使在強(qiáng)堿條件下也不易變性或脫落，可以用高達(dá)0.5M NaOH進(jìn)行CIP和SIP，能有效去除沉淀和變性物質(zhì)，大大降低了抗體產(chǎn)品被內(nèi)毒素污染和批間交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，有利于延長(zhǎng)介質(zhì)使用壽命，同時(shí)還大大降低了CIP和SIP的成本。(2)更溫和的洗脫，避免抗體聚集，提高收率：同型四聚體配基避免了不同配基與抗體Fc段親和性的差異，也消除了某些域?qū)ab段的親和作用，使得洗脫條件更加均一而溫和。Mabselect SuRe介質(zhì)可以用更高的pH進(jìn)行洗脫，有效避免了抗體在低pH下的聚集，產(chǎn)品純度和均一性更高，濁度也更低[14]。(3)不同抗體洗脫所需pH差異?。河捎谙藢?duì)抗體Fab段的親和作用，使得同一種屬亞型的不同抗體分子洗脫所需的條件更接近，有利于平臺(tái)技術(shù)的建立，進(jìn)一步降低了不同的抗體分離純化工藝的研發(fā)成本。(4)SuRe 配基穩(wěn)定性更好：SuRe配基對(duì)堿和蛋白酶更穩(wěn)定，純化過程中脫落更少(<10ppm)，有利于后期脫落配基的進(jìn)一步去除。

　　2.2.4 ProSep-vA Ultra介質(zhì)

　　ProSep-vA Ultra介質(zhì)是將自然界非動(dòng)物性來源的Protein A交聯(lián)于700?的多孔性玻璃珠骨架上，是剛性和不可壓縮的介質(zhì)。ProSep-vA Ultra介質(zhì)具有如下特點(diǎn)：低反壓性;不收縮、不溶脹;高動(dòng)態(tài)載量;極低的Protein A脫落;高重復(fù)使用性，標(biāo)準(zhǔn)化的清洗和除菌操作[27]。

　　2.2.5 ProSep Ultra Plus介質(zhì)

　　ProSep Ultra Plus介質(zhì)是在ProSep-vA Ultra介質(zhì)基礎(chǔ)上優(yōu)化而來，也是目前市場(chǎng)上所有的商品化Protein A介質(zhì)中載量最高的親和層析介質(zhì)之一。它除了具有ProSep-vA Ultra介質(zhì)的全部特點(diǎn)外，還具有載量最高、純化效率更高、工藝更易于放大、成本更低等特點(diǎn)[28]。

　　2.2.6 MEP Hypercel介質(zhì)

　　MEP Hypercel復(fù)合作用模式介質(zhì)是一種靈活的層析介質(zhì)設(shè)計(jì)，也稱之為疏水電荷誘導(dǎo)層析(HCIC)，用于捕獲和純化從實(shí)驗(yàn)室到生產(chǎn)規(guī)模的抗體和各種重組蛋白。MEP Hypercel介質(zhì)由一個(gè)獨(dú)特的連接4-巰基乙基吡啶(4-MEP)的剛性纖維素骨架組成。纖維素骨架賦予高孔隙率、化學(xué)穩(wěn)定性和低非特異性吸附。平均直徑80-100μm，在低反壓下有優(yōu)良的流速特性。MEP Hypercel介質(zhì)在大規(guī)模使用時(shí)具有顯著優(yōu)勢(shì)，基于它的配基結(jié)構(gòu)，可選擇性地捕獲免疫球蛋白。組合其它傳統(tǒng)的方法如離子交換、疏水作用，甚至用在Protein A之后從不同的料液中直接捕獲或中度純化抗體，以增強(qiáng)對(duì)宿主DNA、HCP和聚合體的清除。MEP Hypercel介質(zhì)有助于建立一個(gè)簡(jiǎn)化的工藝流程，節(jié)省操作步驟(例如洗濾、超濾等);預(yù)計(jì)有更長(zhǎng)的使用壽命，因?yàn)樗梢阅褪芸量痰腃IP方法(0.5-1M NaOH，30-60分鐘接觸時(shí)間)，而所有因素都有利于降低成本[29]。

　　2.3最新精細(xì)純化技術(shù)

　　2.3.1 CaptoFamily系列介質(zhì)

　　新型的Capto S，Q系列介質(zhì)是以高流速瓊脂糖為骨架，同時(shí)交聯(lián)了非?！叭彳洝钡钠暇厶擎?，這樣不僅增加了比表面積，同時(shí)降低了傳質(zhì)阻力和空間位阻，使得介質(zhì)在高流速下的動(dòng)態(tài)載量大大增加，有利于提高生產(chǎn)效率，降低成本。

　　Capto S，Q系列介質(zhì)可以裝填在直徑60cm的工業(yè)層析柱中使用高達(dá)500cm/h 的流速進(jìn)行純化(柱高30cm)。這樣不僅有利于工藝放大后大規(guī)模層析柱的填裝，還大大提高了生產(chǎn)效率，每步層析更短的操作時(shí)間也有效避免了抗體分子在分離純化過程中產(chǎn)生各種變體和聚合體，使得收率更好，終產(chǎn)品的活性更高、性質(zhì)更均一。

　　2.3.2 Captoadhere介質(zhì)

　　為了進(jìn)一步減少抗體分離純化步驟，提高特定雜質(zhì)的去除效率，以滿足日益增長(zhǎng)的治療用抗體的生產(chǎn)需要，2007 年初，GE Healthcare公司推出了新型復(fù)合作用模式的強(qiáng)陰離子交換介質(zhì)：Capto adhere介質(zhì)。Capto adher介質(zhì)專為治療用抗體的分離純化而設(shè)計(jì)，其配基綜合了陰離子交換、氫鍵和疏水等多種復(fù)雜的作用方式，因此對(duì)于抗體的聚合體具有非常獨(dú)特而高效的去除能力。此外，通過有效的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(DoE)，流穿模式的Capto adher介質(zhì)還可以同時(shí)有效去除脫落的Protein A配基、HCP、宿主DNA、內(nèi)毒素和潛在的病毒，并使得結(jié)合MabSelect SuRe的抗體兩步層析純化工藝成為現(xiàn)實(shí)(表3)。Capto adhere還具有很強(qiáng)的病毒去除能力，如MVM病毒的去除能力可達(dá)5.9個(gè)Log。目前，新型的兩步法抗體層析純化工藝已經(jīng)被國(guó)內(nèi)外諸多知名藥企廣泛用于多種抗體的分離純化，各項(xiàng)指標(biāo)均符合治療用抗體的要求。Capto adher層析還可以和陰離子交換(Capto Q)和疏水層析等結(jié)合使用，以達(dá)到更高的質(zhì)量要求[15]。

表3 兩步層析純化工藝對(duì)污染物的去除效果[15]

　　2.3.3膜層析技術(shù)

　　PALL Life Science公司自10余年前顛覆性地開發(fā)出獨(dú)一無二的層析產(chǎn)品-Mustang膜層析系列產(chǎn)品后，經(jīng)過不斷地技術(shù)改造，于近年推出全新Mustang Q XT家族，擴(kuò)展了膜層析工藝放大產(chǎn)品線。膜層析技術(shù)，相對(duì)于傳統(tǒng)的柱層析，無需層析填料和層析柱等復(fù)雜構(gòu)件，直接通過膜式過濾器，經(jīng)過簡(jiǎn)單的過濾環(huán)節(jié)即可達(dá)到純化目的。Mustang Q以16層超級(jí)打褶的聚醚砜過濾膜作為基架，上面偶聯(lián)了季胺基等功能基團(tuán)，可以使生物分子流經(jīng)的時(shí)候與功能位點(diǎn)迅速結(jié)合，具有高流速和高動(dòng)態(tài)載量等優(yōu)點(diǎn)。

　　Sartorius Stedim公司也開發(fā)出了一整套膜層析技術(shù)，包括Sartobind S,Q,C和D離子交換、Sartobind IDA(亞氨基二乙酸)金屬螯合、Sartobind醛、Sartobind環(huán)氧基和Sartobind Protein A(重組)等膜層析系列產(chǎn)品。Sartobind在很多蛋白和病毒純化應(yīng)用中可以取代傳統(tǒng)耗時(shí)、繁瑣的層析步驟。膜吸附器的快速純化特點(diǎn)使蛋白分離可以在高流速下獲得高收率，較傳統(tǒng)柱層析流速最高能提高100倍，達(dá)到20-40 CV/min。傳統(tǒng)顆粒膠95%以上的結(jié)合位點(diǎn)集中在顆粒膠內(nèi)部。Sartobind膜層析的結(jié)合位點(diǎn)是均一地交聯(lián)到交叉偶聯(lián)的增強(qiáng)纖維素骨架內(nèi)0.5-1μm厚的薄層上。大孔結(jié)構(gòu)和快速吸附結(jié)合特性使膜吸附器可以忽略擴(kuò)散時(shí)間因素。同時(shí)多微孔膜結(jié)構(gòu)不存在傳統(tǒng)顆粒膠的孔內(nèi)擴(kuò)散問題。在對(duì)流情況下，流動(dòng)相的分子運(yùn)動(dòng)只由泵壓力決定。因此，膜吸附器具有操作周期極短、流速和處理能力極高的特點(diǎn)[30]。

　　與離子交換柱層析相比，離子交換膜層析技術(shù)已經(jīng)被證明利用高動(dòng)態(tài)結(jié)合能力吸附大量的生物分子，如病毒、HCP和宿主DNA。最近，陰離子交換膜層析技術(shù)已經(jīng)被作為柱層析技術(shù)的替代技術(shù)用于Protein A親和捕獲后的mAb中微量污染物的去除[16]。

　　2.4終產(chǎn)品的濃縮洗濾

　　多維純化得到的洗脫峰可以用Kvick Lab/Process盒式膜包進(jìn)行快速濃縮和緩沖液置換。Kvick盒式膜包的優(yōu)點(diǎn)有：(1)無熱原：很多時(shí)候，僅用0.5M NaOH 清洗難以徹底去除膜表面的熱原。Kvick盒式膜包化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，可以使用1M NaOH在40-50℃下進(jìn)行徹底的SIP/CIP，避免最終超濾濃縮時(shí)引入熱原而影響產(chǎn)品質(zhì)量。(2)孔徑均一、速度快：Kvick盒式膜包孔徑更均一，甚至可以使用50-100K的膜包進(jìn)行抗體濃縮而不漏過，速度更快，大大節(jié)省了操作時(shí)間。(3)易于線性放大：通過保持流速、TMP等參數(shù)恒定，可以直接線性放大到生產(chǎn)規(guī)模。

　　Amicon Ultra系列超濾離心管可以用來進(jìn)行抗體的快速濃縮、脫鹽及緩沖液置換。它具有如下特點(diǎn)：(1)效率高：一步法離心達(dá)到25到80倍濃縮。(2)節(jié)省時(shí)間：垂直結(jié)構(gòu)的膜，避免堵膜，減少濃差極化，可以用超快離心速度極短時(shí)間完成;最少10分鐘即可完成濃縮、脫鹽或緩沖液置換。(3)收率高：獨(dú)特的反轉(zhuǎn)離心設(shè)計(jì)，有利于取得最大回收率且避免了人為移液誤差;低吸附濾膜和聚丙烯內(nèi)殼，使回收率高達(dá)90%以上。(4)不漏液、無損失：100%完整性測(cè)試確保不漏液;獨(dú)特的死體積設(shè)計(jì)避免過度離心至干，沒有樣品損失。(5)廣泛的化學(xué)相容性：與廣泛的溶劑兼容，適用于pH1-pH9，熱封膜杜絕了粘合劑和下游溶出物污染。

　　Vivaspin系列超濾離心管同樣是進(jìn)行蛋白質(zhì)快速濃縮和緩沖液置換的常用產(chǎn)品。獲得專利的垂直膜配合狹長(zhǎng)的流道設(shè)計(jì)，有效地避免濾膜堵塞，提高濃縮速度;同時(shí)在濃縮管底部設(shè)計(jì)有死端結(jié)構(gòu)，確保即使離心時(shí)間過長(zhǎng)也不會(huì)發(fā)生樣品被甩干的現(xiàn)象。Vivaspin可靈活選用三種不同材質(zhì)的超濾膜：聚醚砜、三醋酸纖維和Hydrosart。它的另一個(gè)特點(diǎn)是有兩種回收濃縮液的方法，既可以直接用移液器從濃縮管底部吸取，也可以將濃縮液反轉(zhuǎn)離心到回收管內(nèi)，加蓋密封保存，這兩種方法都保證了高回收率。Vivaspin經(jīng)過一次離心，最高可以將蛋白溶液濃縮300倍。

　　2.5終產(chǎn)品的除菌除病毒過濾

　　濃縮后的樣品，最終經(jīng)過0.22μm無菌濾器進(jìn)行除菌過濾。ULTA Pure SG，HC除菌濾器具有過濾速度快、化學(xué)穩(wěn)定性好、載量高和溶出物少等優(yōu)點(diǎn)，細(xì)菌挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)表明其除菌能力大于7log。除菌過濾過程的優(yōu)化主要從三個(gè)方面入手：操作過程中過膜壓力的控制、過膜流速以及單位膜載量控制，這三個(gè)參數(shù)優(yōu)化以后，可以在同種類型、材質(zhì)的NFF膜上進(jìn)行線性放大，否則很容易影響收率。

　　Durapore除菌級(jí)親水性濾膜由親水性PVDF材料制造，具有可靠的除菌保證以及低蛋白吸附量、低析出、無纖維脫落、廣泛的化學(xué)兼容性等優(yōu)點(diǎn)，是常用的除菌濾膜。Durapore 0.22μm親水性濾膜用于液體除菌或去除微粒，0.1μm親水性濾膜用于液體中去除微粒、微生物和支原體。裝有Durapore親水性濾膜的濾器有Millipak、Opticap XL、Opticap XLT、筒式濾器和Optiscale等。Millipak濾器獨(dú)特的堆疊盤狀設(shè)計(jì)使殘留量最小并且無顆粒脫落，因此適合于高附加值產(chǎn)品的終端過濾和灌裝。Millipak和Opticap XL濾器都有O型圈墊片和軟管倒鉤連接的上游排氣閥和排空閥設(shè)計(jì)，使操作簡(jiǎn)單易控。Opticap XL和XLT濾器的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，特別耐高溫、高壓條件，在除菌過程中提供更高的穩(wěn)定性和可靠性，同時(shí)更易清洗。Optiscale一次性濾器專為小規(guī)模工藝篩選和工藝放大所設(shè)計(jì)，是工藝評(píng)估的理想工具。

　　目前被廣泛應(yīng)用的生物制品病毒去除的方法是納米膜過濾。納米膜過濾有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)針對(duì)性強(qiáng)，實(shí)用性廣：納米膜過濾只與病毒和目的蛋白的大小有關(guān)，無論病毒是否有脂包膜外殼、是否耐熱，納米膜過濾都能將之去除。(2)毒性小，下游污染少：能有效去除殺滅病毒后可能留下的如抗原和核酸蛋白混合物等病毒標(biāo)志物，有效降低下游污染，是納米膜的另一特點(diǎn)。大多數(shù)病毒滅活處理都使用有毒或致突變的理化試劑，從而必須在使用后從蛋白質(zhì)溶液中清除，而納米膜過濾不存在毒性問題，只是在驗(yàn)證中要考慮到濾器浸出物的風(fēng)險(xiǎn)。(3)蛋白活性高，回收率高：納米膜過濾是在正常條件下的pH、滲透壓和溫度下進(jìn)行的溫和的生產(chǎn)步驟，其蛋白回收率和活性都很高，通常在90%—95%。基于體外分析、實(shí)驗(yàn)研究和臨床經(jīng)驗(yàn)，納米膜過濾試驗(yàn)都沒有顯示出蛋白質(zhì)改變或是新抗原的產(chǎn)生。納米膜過濾不改變制品特性，這一特點(diǎn)促進(jìn)了監(jiān)管機(jī)構(gòu)認(rèn)可和產(chǎn)品的注冊(cè)。

　　日本Asahi Kasei公司于1989年推出了第一款專門為清除生物制藥產(chǎn)品中病毒顆粒而設(shè)計(jì)的過濾器Planova，由親水銅銨再生纖維素制成的中空纖維微孔膜，裝入聚碳酸酯殼體中。Millipore公司的Viresolve NFP膜是一種復(fù)合PVDF膜，過濾盒被設(shè)計(jì)來從高純蛋白溶液中移除小型病毒，如B19，蛋白質(zhì)溶液中，B19的去除量通常>4 log。PALL Life Science公司的Ultipor VF DV50和DV20膜式過濾器可以從生物流體中去除顯著數(shù)量級(jí)的病毒，同時(shí)目標(biāo)蛋白可以很好地通過。濾芯由三層獨(dú)特的親水、低蛋白吸附的PVDF濾膜經(jīng)新月型打褶方式構(gòu)成，過濾面積大，具有可靠、安全和高流量等特點(diǎn)。Sartorius Stedim生產(chǎn)的Virosart CPV為聚醚砜過濾器，能去除>4 log的PPV和>6 log的逆轉(zhuǎn)錄病毒。

　　2.5擴(kuò)張柱床吸附層析技術(shù)

　　擴(kuò)張柱床吸附層析技術(shù)(EBA)是上世紀(jì)九十年代初期進(jìn)入下游生產(chǎn)，整合了發(fā)酵和下游純化的技術(shù)。新一代STREAMLINE Direct擴(kuò)張柱床設(shè)備及介質(zhì)是EBA技術(shù)中最成熟的產(chǎn)品。通過條件優(yōu)化，STREAMLINE能直接從渾濁的發(fā)酵液中捕獲目標(biāo)生物分子，細(xì)胞碎片及不吸附的雜質(zhì)穿過擴(kuò)張床內(nèi)懸浮的介質(zhì)被沖洗掉，將以往澄清、濃縮、捕獲等步驟整合為一步，達(dá)到粗純化的效果(圖2)[17]。

　　STREAMLINE的操作過程如下[17-18]：(1)起始：將STREAMLINE介質(zhì)倒入擴(kuò)張柱中。(2)平衡：從下向上流的緩沖液，將STREAMLINE柱內(nèi)的吸附介質(zhì)懸浮起來，形成穩(wěn)定的、充分平衡好的擴(kuò)張床。(3)上樣：發(fā)酵液帶菌體從柱底進(jìn)入，目標(biāo)生物產(chǎn)品吸附在STREAMLINE介質(zhì)上;不吸附的宿主雜質(zhì)及菌體碎片隨液流從柱頂排出。(4)淋洗/穿透：進(jìn)一步用緩沖液將不吸附的雜質(zhì)洗掉。(5)洗脫：洗脫液洗脫目標(biāo)生物產(chǎn)品。(6)CIP/再生：用1M NaOH+1M NaCl進(jìn)行CIP。整個(gè)操作過程如圖3所示。

　　圖2　傳統(tǒng)純化工藝與STREAMLINE [17]

　　圖3 STREAMLINE的基本工作原理和操作過程[18]

　　(箭頭示液體過柱時(shí)的流向)

　　STREAMLINE介質(zhì)是一系列包裹著石英芯，以瓊脂糖為骨架的介質(zhì)。特殊設(shè)計(jì)的STREAMLINE擴(kuò)張柱床可以產(chǎn)生穩(wěn)定的向上拔的擴(kuò)張液流，每一顆不同比重的STREAMLINE介質(zhì)，懸浮在自身重力和擴(kuò)張升力平衡的位置原地?cái)_動(dòng)。STREAMLINE 技術(shù)是穩(wěn)態(tài)擴(kuò)張，樣品流均勻分布整個(gè)床體，目標(biāo)產(chǎn)物吸附均勻，穿透小，回收率高，類似于固定床吸附性層析[19]。

　　3. 抗體最新下游技術(shù)應(yīng)用實(shí)例

　　Lonza Biologics公司是全球最大的抗體合同生產(chǎn)商之一，為了開發(fā)一個(gè)穩(wěn)定的20000L的抗體生產(chǎn)工藝，其純化開發(fā)部門對(duì)多個(gè)不同的抗體親和層析凝膠進(jìn)行了有效的比較，他們發(fā)現(xiàn)Mabselect SuRe的動(dòng)態(tài)載量高、使用壽命最長(zhǎng)、Protein A脫落最低，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)明確支持放大到1.4m直徑的柱子用于20000L培養(yǎng)規(guī)模的經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)[4]。

　　德國(guó)的Roche公司一種用于腫瘤治療的單抗已進(jìn)入臨床Ⅲ期。他們將目前幾種Protein A介質(zhì)進(jìn)行充分的比較之后，選擇了高載量、更易于裝柱和壽命更長(zhǎng)的Mabselect。目的抗體是通過無血清培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染的雜交B淋巴細(xì)胞表達(dá)的IgG1。將過濾后的無細(xì)胞上清上樣到Mabselect填充的FineLINE柱，直徑300cm，柱高20cm，上樣的濃度是30mg/ml。洗脫后，洗脫液立即用磷酸鉀中和pH值到6.8-7.0，再用凝膠過濾檢測(cè)，結(jié)果表明比活超過90%，純度在95%以上[20]。

　　Cytheris公司是法國(guó)一家生物制藥公司，目前正在研制一種用CHO細(xì)胞表達(dá)的免疫調(diào)節(jié)劑(臨床Ⅱ期)。原先的工藝采用傳統(tǒng)層析法，但不能穩(wěn)定去除病毒。改進(jìn)后，在工藝的第一步使用Mustang Q對(duì)污染物進(jìn)行捕獲，取得了25%去除率的良好結(jié)果;同時(shí)對(duì)MVM、MLV和Re03三種病毒也達(dá)到超過4個(gè)Log的滴度降效果，而整個(gè)工藝對(duì)病毒的去除效率普遍提高了7-11個(gè)Log。說明Mustang Q的使用對(duì)下游層析起到了很好的保護(hù)作用。

　　在第五屆生物制藥工藝優(yōu)化大會(huì)上，Crucell公司介紹了他們對(duì)腺病毒(AAV)純化工藝的摸索。與傳統(tǒng)的層析填料相比，Mustang Q膜層析的開放孔道的設(shè)計(jì)使對(duì)病毒的動(dòng)態(tài)載量大大提高30倍左右，回收率在80%以上。用40L的膜層析柱相當(dāng)于1000L的傳統(tǒng)層析柱的效果，節(jié)省了驗(yàn)證工作，提高了工藝經(jīng)濟(jì)性，十分有利于放大生產(chǎn)。

　　德國(guó)的Boehringer Mannheim公司生物制藥部，用STREAMLINE技術(shù)代替?zhèn)鹘y(tǒng)工藝生產(chǎn)400L CHO細(xì)胞培養(yǎng)的Fc融合蛋白，結(jié)果樣品回收率提高14%，緩沖液減少25%，時(shí)間縮短47%[17]。

　　世界最大的制藥公司-GlaxoSmithKline公司，使用特別設(shè)計(jì)的BioProcess全自動(dòng)層析系統(tǒng)和STREAMLINE擴(kuò)張柱生產(chǎn)藥用脂蛋白疫苗，比原工藝產(chǎn)品體積縮小2倍，純化系數(shù)1.5，內(nèi)毒素減少100倍[17]。

　　日本YOSHITOMI公司正在使用多套STREAMLINE 1000系統(tǒng)生產(chǎn)人重組白蛋白，與原生產(chǎn)工藝產(chǎn)品純度相同，產(chǎn)率提高30%，時(shí)間減少一半，年產(chǎn)量為12.5噸[17]。

　　AVECIA公司重新設(shè)計(jì)臨床Ⅲ期藥品生產(chǎn)工藝，選用STREAMLINE技術(shù)及SOURCE新型凝膠，生產(chǎn)效率提高12倍，回收率提高1倍[17]。

　　2001年，ILEX制藥公司的CAMPATH獲得FDA批準(zhǔn)。該單克隆抗體使用Sartobind Q離子交換層析模塊以流穿的方式進(jìn)行精制，這是膜吸附器首次被批準(zhǔn)應(yīng)用于治療性蛋白的生產(chǎn)，證明了膜層析技術(shù)通過了證實(shí)和測(cè)試[30]。

　　4. 展望

　　隨著抗體產(chǎn)品上游大規(guī)模高效培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,實(shí)驗(yàn)室規(guī)模哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)水平可以達(dá)到25g/L，如果這一水平能夠有效放大到生產(chǎn),將對(duì)下游生產(chǎn)純化帶來更大的壓力。所以下游純化工藝的技術(shù)發(fā)展也是勢(shì)在必行。

　　以下一些發(fā)展方向可能成為下游工藝未來發(fā)展的重要關(guān)注點(diǎn)：(1)剛性更好、載量更高、耐堿性更好的完全親水瓊脂糖凝膠的開發(fā)[4]。(2)優(yōu)化操作次序，降低緩沖液消耗的更大規(guī)模生產(chǎn)線的應(yīng)用[21]。(3)通過單抗的氨基酸序列預(yù)測(cè)下游工藝關(guān)鍵參數(shù)：親和層析洗脫pH條件、離子交換層析洗脫pH和鹽濃度條件、病毒滅活pH等[22]。(4)下游工藝的成本消耗占全部成本的50-80%，親和捕獲是下游工藝的最關(guān)鍵步驟，通過改進(jìn)親和配體，提高捕獲能力，節(jié)省成本[23]。(5)新型層析系統(tǒng)全程實(shí)時(shí)控制純化過程，在線檢測(cè)HCP、宿主DNA、Protein A等的含量[24]。(6)由于在去除雜質(zhì)方面的優(yōu)勢(shì)，膜層析將會(huì)得到飛速的發(fā)展，未來工藝甚至可能完全基于膜層析而不是柱層析[25]。

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