厭氧菌的分離培養(yǎng)與初步鑒別！

厭氧菌（anaerobicbacteria）是一類在無氧條件下比在有氧環(huán)境中生長(zhǎng)好的細(xì)菌，而不能在空氣（18%氧氣）和（或）10％二氧化碳濃度下的固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的細(xì)菌。這類細(xì)菌缺乏完整的代謝酶體系，其能量代謝以無氧發(fā)酵的方式進(jìn)行。厭氧菌是人體正常菌群的組成部分，廣泛存在于人體皮膚和腔道的深部黏膜表面，在組織缺血、壞死，或者需氧菌感染的情況下，導(dǎo)致局部組織的氧濃度降低，才發(fā)生厭氧菌感染。

一、厭氧菌標(biāo)本的送檢方法與處理

標(biāo)本送到實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)在20～30min內(nèi)處理完畢，最遲不超過2h，以防止標(biāo)本中兼性厭氧菌過度繁殖而抑制厭氧菌的生長(zhǎng)。如不能及時(shí)接種，可將標(biāo)本置室溫保存（一般認(rèn)為，冷藏對(duì)某些厭氧菌有害，而且在低溫時(shí)氧的溶解度較高）。

1）針筒運(yùn)送：一般用無菌針筒抽取標(biāo)本后，排盡空氣，針頭插入無菌橡皮塞，以隔絕空氣，立即送檢。這種方法多用于液體標(biāo)本的運(yùn)送，如血液、膿液、胸腹水、關(guān)節(jié)液等醫(yī).學(xué)教育網(wǎng)搜集整理。

2）無菌小瓶運(yùn)送：一般采用無菌的青霉素小瓶，瓶?jī)?nèi)加一定量的培養(yǎng)基和少量氧化還原指示劑，用橡皮蓋加鋁蓋固定密封，排除瓶?jī)?nèi)空氣，充以C02氣體。同時(shí)先觀察瓶?jī)?nèi)氧化還原指示劑的顏色，以判斷瓶?jī)?nèi)是否為無氧環(huán)境，如合格將用無菌注射器將液體標(biāo)本注入瓶中即可。

3）棉拭子運(yùn)送：一般不采用棉拭子運(yùn)送，如果使用該方法，一定使用特制運(yùn)送培養(yǎng)基，確保無氧環(huán)境，確保不被污染，確?？焖偎蜋z。

4）厭氧罐或厭氧袋運(yùn)送：將厭氧罐或厭氧袋內(nèi)裝入可有效消耗氧氣的物質(zhì)，確保無氧環(huán)境。該方法一般用于運(yùn)送較大的組織塊或床邊接種的培養(yǎng)皿等。

二、厭氧菌的分離培養(yǎng)

厭氧菌的分離培養(yǎng)主要分初代培養(yǎng)和次代培養(yǎng)兩個(gè)階段，其中初代培養(yǎng)相對(duì)比較困難，關(guān)鍵的問題就是厭氧環(huán)境和培養(yǎng)基的選擇。初代培養(yǎng)的一般原則是：

1）先將標(biāo)本涂片染色直接鏡檢，指導(dǎo)培養(yǎng)基的選擇。

2）盡量選用在厭氧菌中覆蓋面寬的非選擇性培養(yǎng)基。

3）多選1～2種覆蓋面不同的選擇性培養(yǎng)基。

4）盡量保證培養(yǎng)基新鮮。

5）要考慮到微需氧菌存在的可能。

1.選用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基接種：應(yīng)接種固體和液體兩種培養(yǎng)基；

（1）培養(yǎng)基的使用，應(yīng)注意下列各點(diǎn)：

1）盡量使用新鮮培養(yǎng)基，2～4h內(nèi)用完；

2）應(yīng)使用預(yù)還原培養(yǎng)基，預(yù)還原24～48h更好；

3）可采用預(yù)還原滅菌法制作的培養(yǎng)基（用前于培養(yǎng)基中加入還原劑，如L-半胱氨酸、硫乙醇酸鈉、維生素C及葡萄糖等，盡可能使預(yù)還原劑處于還原狀態(tài)）；

4）液體培養(yǎng)基應(yīng)煮沸10min，以驅(qū)除溶解氧，并迅速冷卻，立即接種；

5）培養(yǎng)厭氧菌的培養(yǎng)基均應(yīng)營(yíng)養(yǎng)豐富，并加有還原劑與生激因子（血清、維生素K、氯化血紅素、聚山梨酯-80等）。

（2）培養(yǎng)基的選擇：初次培養(yǎng)一般都使用選擇培養(yǎng)基和非選擇培養(yǎng)基。

1）非選擇培養(yǎng)基：本培養(yǎng)基使分離的厭氧菌不被抑制，幾乎能培養(yǎng)出所有的厭氧菌。常使用心腦浸液瓊脂（BHI）、布氏瓊脂（BR）、胰豆胨肝粉瓊脂（GAM）、胰胨酵母瓊脂（EG）、CDC厭氧血瓊脂等。

2）選擇培養(yǎng)基：為有目的選擇常見厭氧菌株，以便盡快確定厭氧的種類。

2.每份標(biāo)本至少接種3個(gè)血平板，分別置于有氧，無氧及5%～10 2環(huán)境中培養(yǎng)，以便正確地培養(yǎng)出病原菌，從而判斷其為需氧菌、兼性厭氧菌、微需氧菌或厭氧菌中的哪一類。

3.厭氧培養(yǎng)法

（1）厭氧罐培養(yǎng)法。

（2）氣袋法。

（3）氣體噴射法：又稱轉(zhuǎn)管法。

（4）厭氧手套箱培養(yǎng)法：是迄今厭氧菌培養(yǎng)的儀器之一。

（5）其他培養(yǎng)法：平板焦性沒食子酸法；生物耗氧法；高層瓊脂培養(yǎng)法。

4.厭氧狀態(tài)的指示：美藍(lán)和刃天青。無氧時(shí)均呈白色，有氧時(shí)美藍(lán)呈藍(lán)色，刃天青呈粉紅色。

5.分離培養(yǎng)厭氧菌失敗的原因：

①培養(yǎng)前未直接涂片和染色鏡檢；

②標(biāo)本在空氣中放置太久或接種的操作時(shí)間過長(zhǎng)；

③未用新鮮配制的培養(yǎng)基；

④未用選擇培養(yǎng)基；

⑤培養(yǎng)基未加必要的補(bǔ)充物質(zhì)；

⑥初代培養(yǎng)應(yīng)用了硫乙醇酸鈉作為厭氧菌培養(yǎng)基；

⑦無合適的厭氧罐或厭氧裝置漏氣；

⑧催化劑失活；

⑨培養(yǎng)時(shí)間不足；

⑩厭氧菌的鑒定材料有問題。

三、厭氧菌直接鏡檢初步鑒別

coccus，球菌；b：bacillus，桿菌。

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