色譜柱技術(shù)始于上世紀(jì)50年代，隨著填料和填充技術(shù)的發(fā)展，色譜柱技術(shù)日益成熟，功能也日趨完善，目前已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、環(huán)保、材料、食品、藥物開發(fā)等領(lǐng)域。

液相色譜柱在色譜分析系統(tǒng)中主要起著分離檢測物質(zhì)的作用，如同色譜系統(tǒng)的心臟，同時(shí)也是易損耗品。為了減少損耗，色譜柱的使用維護(hù)至關(guān)重要！

液相色譜柱使用過程常用問題包括色譜柱連接、色譜柱活化、色譜柱使用、色譜柱維護(hù)、色譜柱保存等。

01

色譜柱連接

色譜柱安裝方向

色譜柱安裝應(yīng)按照同一個(gè)方向連接使用，且需要按照色譜柱上的方向指示連接，盡量避免色譜柱反向連接！

常見色譜柱連接的問題主要有兩種，安裝色譜柱時(shí)管線伸出接頭長度過長，使得螺紋擰入較淺，會(huì)導(dǎo)致密封性不好而漏液，進(jìn)一步引起基線漂移或響應(yīng)降低；反之，會(huì)在管線前段出現(xiàn)死體積，引起峰形展寬，靈敏度降低。

理想的接頭連接應(yīng)具備以下特性：管線與接口之間無死體積；在超高壓和高溫下始終避免泄漏；優(yōu)異的長期使用穩(wěn)定性，防止管線滑動(dòng)；簡便易用。

管線的選擇也非常重要，分析型液相系統(tǒng)常用的規(guī)格是0.12和0.17mm內(nèi)徑的管線。更換管線時(shí)首先要確認(rèn)當(dāng)前管線的規(guī)格、并更換相同內(nèi)徑和長度的管線，否則會(huì)造成更換前后結(jié)果的不一致，因?yàn)楣芫€體積會(huì)影響系統(tǒng)柱外體積，從而影響峰形和保留時(shí)間。 

02

反相柱活化平衡

1） 首先，使用甲醇或乙腈沖洗約20 倍柱體積 。

2）若流動(dòng)相含有緩沖鹽，使用與流動(dòng)相中初始比例相等比例的超純水和有機(jī)相沖洗過渡約20 倍柱體積，再用含緩沖鹽的流動(dòng)相平衡沖洗約20 倍柱體積或以上。

3） 若流動(dòng)相不含緩沖鹽，可直接用流動(dòng)相平衡色譜柱，大約20 倍柱體積或以上。

4）當(dāng)基線和壓力平穩(wěn)后測試，判斷是否充分平衡以連續(xù)進(jìn)樣結(jié)果的重現(xiàn)為準(zhǔn)。若不夠可延長流動(dòng)相的平衡時(shí)間。

03

反相柱沖洗保存

1）使用50:50 甲醇或乙腈與水的混合溶液沖洗20-30 倍的柱體積；

2）使用純甲醇或乙腈沖洗20-30倍柱體積；

3）儲存之前將堵頭緊緊密封在柱端接頭上，以免填料變干。

04

反相色譜柱清洗再生

清洗或反沖清洗反相色譜柱時(shí)，用以下溶劑至少各30倍柱體積沖洗色譜柱：

斷開色譜柱與檢測器的連接，將管線留在色譜柱末端，將其放入接收液體的燒杯中，先用不含緩沖液鹽的流動(dòng)相沖洗（水/有機(jī)相），然后用 100% 有機(jī)相（甲醇和乙腈）沖洗，檢查壓力是否回歸正常，如果沒有，再進(jìn)行下一步操作。

如壓力沒有回歸正常，丟棄色譜柱或考慮用更強(qiáng)的條件清洗：75% 乙腈/25% 異丙醇、100% 異丙醇、100% 二氯甲烷 、100% 己烷。

值得注意的是，無論是使用己烷還是二氯甲烷，使用之前或恢復(fù)使用反相流動(dòng)相之前必須用異丙醇進(jìn)行沖洗。

關(guān)于色譜柱反沖

雖然色譜柱不應(yīng)輕易反沖，但當(dāng)明確知道超壓來自顆粒物堵塞篩板或柱頭污染時(shí)，反沖是有效補(bǔ)救方法。反沖色譜柱可使顆粒物快速被沖出，此外還可快速?zèng)_出柱頭強(qiáng)吸附污染物，柱子反沖后仍然正向連接使用。不過，反沖也會(huì)帶來負(fù)面影響，如可能導(dǎo)致柱床松動(dòng)、發(fā)生保留時(shí)間改變、小粒徑的色譜柱反沖可能導(dǎo)致填料流出等。

其中，可以反沖的色譜柱有：粒徑大于2um的色譜柱（2.7、3、3.5、4、5 m等）；而不可反沖的色譜柱有：粒徑小于2um的色譜柱（1.8 m RRHD/RRHT；1.9 m Poroshell）。

05

色譜柱使用過程中常見問題

液相色譜柱使用過程中常見的問題包括pH值、溫度、溶劑耐受、壓力、樣品等。色譜柱使用條件不得超出廠家建議的范圍，包括壓力，pH范圍，水相耐受，柱溫等。當(dāng)測試條件接近色譜柱使用范圍的極限值時(shí)，柱壽命會(huì)受影響。

01

C18柱子如何調(diào)PH和溫度以提高分離度呢？

答：通過調(diào)整pH和柱溫優(yōu)化分離度，這是方法開發(fā)中非常重要的手段。簡單來講，中性或不可電離化合物對pH變化不敏感。對于可電離化合物而言，可以通過調(diào)整流動(dòng)相pH值，控制化合物電離狀態(tài)來改變化合物的反相保留。降低pH可增大酸性化合物保留，而提高pH則可增加堿性化合物保留。通過調(diào)整pH改變化合物保留進(jìn)而優(yōu)化各個(gè)組分之間的分離度。

通常提高柱溫使得傳質(zhì)加快，保留也會(huì)降低，但是不同化合物保留對溫度變化敏感程度不同，因此也可以通過調(diào)整柱溫改變各個(gè)組分的保留時(shí)間來優(yōu)化分離度。

02

色譜柱總超壓可能是什么原因呢？

答：超壓一般是液相流路內(nèi)部包括色譜柱在內(nèi)可能有堵塞。需要先做分段排查確定堵塞的部位，再根據(jù)堵塞部位排查引起堵塞的可能原因。

如果是色譜柱堵塞，比較常見的原因有很多，如樣品臟、基質(zhì)復(fù)雜并且沒有經(jīng)過良好的預(yù)處理，或者預(yù)處理之后進(jìn)入液相系統(tǒng)后又析出從而造成堵塞或污染（解決方法：加強(qiáng)樣品預(yù)處理）；色譜柱超壓或超出pH范圍使用導(dǎo)致填料碎裂，碎屑顆粒堵塞色譜柱（解決方法：根據(jù)測試條件選擇合適色譜柱，避免超范圍使用）；儀器使用過程中部件磨損碎屑造成的堵塞（解決方法：及時(shí)更換受損部件）等等，都會(huì)引起系統(tǒng)色譜柱壓力升高。

03

C18柱子出峰時(shí)間拖后是什么因素影響？用一段時(shí)間出峰時(shí)間就拖后了，請問與流動(dòng)相有沒有關(guān)系？

答：液相色譜中影響化合物保留的主要因素包括：樣品，色譜柱，流動(dòng)相（流速，組成，比例等），柱溫等。使用過程中發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間漂移的話，需要從以下幾個(gè)影響因素進(jìn)行排查：可以先通過對比保留時(shí)間漂移前后相同條件下的壓力曲線是否重現(xiàn)，從而初步排查可能的原因。若壓力曲線不重現(xiàn)，首先確認(rèn)測試條件是否有改動(dòng)，檢查流動(dòng)相流速，組成，比例等是否改變，是否存在漏液或進(jìn)氣泡引起的流速和比例變化；對流動(dòng)相組成變化敏感的樣品和方法，應(yīng)確保每次配制流動(dòng)相的重現(xiàn)性；檢查色譜柱是否堵塞污染；儀器控溫是否準(zhǔn)確等等，可能的原因比較多，具體原因需要進(jìn)一步排查。

04

色譜柱用什么流動(dòng)相保存好？用純有機(jī)試劑是否容易干？

答：反相柱可以用HPLC級的甲醇或者乙腈保存，注意緊密連接堵頭。正常情況下只要堵好堵頭，溶劑是不容易干的。當(dāng)然在保存溶劑中添加5%-10%的水，也沒有問題。

05

乙腈流動(dòng)相總是容易聚合，有沒有什么解決辦法?

答：乙腈的聚合需要一定條件和時(shí)間，務(wù)必使用品質(zhì)可靠的HPLC級溶劑，并且保證所使用溶劑盡可能新鮮。如果是放置保存比較久的乙腈溶劑，使用之前先過濾一下再用會(huì)有一定改善。

06

小分子極性物質(zhì)一般選用什么液相色譜柱？

答：可以先嘗試用能夠耐受高比例水相的柱子，提高流動(dòng)相水相比例來增強(qiáng)保留。如果是可電離化合物，如酸性或者堿性化合物，可以在反相模式下先嘗試通過調(diào)整流動(dòng)相pH增大保留，酸性化合物需降低流動(dòng)相pH，堿性化合物則提高流動(dòng)相pH，根據(jù)pH條件選擇可以耐受的色譜柱。如果調(diào)整pH后反相模式保留仍然很弱，您還可以考慮使用其他保留模式的色譜柱，例如HILIC柱，HILIC-Z,HILIC-OH5，或者純硅膠的HILIC柱等等，也可以使用離子交換色譜柱或者正相色譜等。

07

柱子分離效果差了該怎么處理？

答：導(dǎo)致色譜柱分離度降低的原因，主要是色譜柱柱效下降及色譜柱選擇性發(fā)生改變。引起柱效下降的原因比較多，如果是連接不當(dāng)造成的柱效損失，重新正確連接即可。如果是色譜柱使用中由于柱子污染引起的柱效下降或選擇性改變導(dǎo)致的分離度降低，可以嘗試對柱子進(jìn)行清洗再生。如果是色譜柱本身的損傷引起的柱效下降分離度變化，這種通常是不可逆的，只能更換色譜柱，并且在后續(xù)使用新色譜柱的時(shí)候盡量避免各種損傷柱子的操作。