摘要：本應(yīng)用簡報(bào)介紹了 mAb 產(chǎn)品中亞 ppm 宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)雜質(zhì)的定量分析方法。本工作流程采用 Agilent AssayMAP Bravo 平臺、Agilent 1290 Infinity II 液相色譜系統(tǒng)和 Agilent 6495C 三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng)。

前言：宿主細(xì)胞蛋白 (HCP) 雜質(zhì)是低濃度的蛋白質(zhì)雜質(zhì)，來源于生物藥物生產(chǎn)過程中的宿主生物。由于它們可能影響產(chǎn)品安全性和功效，因此根據(jù)法規(guī)要求必須對藥品中的 HCP 進(jìn)行監(jiān)測和控制[1]。傳統(tǒng)上，酶聯(lián)免疫吸附測定法 (ELISA) 是定量分析蛋白質(zhì)治療藥物中 HCP 的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而，ELISA 的特異性和覆蓋率不足以鑒定并定量分析各種 HCP。因此，LC/MS 技術(shù)成為 HCP 分析的另一選擇。在 HCP 的 LC/MS 定量分析過程中，主要挑戰(zhàn)在于低豐度 HCP 肽段與高豐度藥品肽段的共洗脫。因此需要在藥品基質(zhì)的高背景下對低豐度肽進(jìn)行靈敏而可重現(xiàn)的定量分析。

本應(yīng)用簡報(bào)介紹了用于宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)高靈敏度定量分析的完整工作流程解決方案，

包括：

用于樣品自動(dòng)前處理的 Agilent AssayMAP Bravo 平臺 用于樣品分離的 Agilent 1290 Infinity II 液相色譜儀

用于數(shù)據(jù)采集的 Agilent 6495C 三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng)

用于 MRM 方法開發(fā)的 Skyline 軟件中的安捷倫自動(dòng)化工具

使用 Agilent MassHunter 定量分析軟件和 Skyline 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理使用基于多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM) 的同位素稀釋方法，結(jié)果顯示可準(zhǔn)確定量低至亞 ppm (ng/mg) 濃度的 HCP。

實(shí)驗(yàn)部分儀器 Agilent AssayMAP Bravo 系統(tǒng) (G5571AA) Agilent 1290 Infinity II 液相色譜系統(tǒng)包括： Agilent 1290 Infinity II 高速泵 (G7120A) Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B)，配備樣品冷卻裝置選件（選件 100） Agilent 1290 Infinity II 柱溫箱 (G7116B) Agilent 6495C 三重四極桿 LC/MS 系統(tǒng) 安捷倫噴射流 ESI 離子源 (G1958-65138)

材料：人 IgG1 mAb（來自合作伙伴的一種研發(fā)產(chǎn)品）由中國倉鼠卵巢 (CHO) 細(xì)胞產(chǎn)生，并經(jīng)過 Protein A 純化。重型穩(wěn)定同位素標(biāo)記 (SIL) 肽標(biāo)準(zhǔn)品由第三方供應(yīng)商定制合成（表 1）。所有 SIL 肽經(jīng) HPLC 純化，質(zhì)量通過 LC/MS 和氨基酸分析測定。

樣品前處理使用 AssayMAP Bravo 系統(tǒng)進(jìn)行 mAb 樣品變性、還原、烷基化和胰蛋白酶解。將 SIL 肽以等摩爾濃度混合，并以 8 種不同濃度（每種 SIL 肽濃度為 6.25、 12.5、25、62.5、125、250、12500、 125000 amol/ g）加入樣品酶解物中，用于定量分析。

LC/MS 分析：使用 9 分鐘液相色譜梯度，通過 6495C 三重四極桿 LC/MS 在 dMRM 模式下分析樣品。表 1 和表 2 詳細(xì)列出了色譜和質(zhì)譜分析的實(shí)驗(yàn)條件。使用與 Skyline 和 Agilent MassHunter 工作站軟件集成的安捷倫自動(dòng)化工具對 LC-dMRM 方法進(jìn)行自動(dòng)優(yōu)化。