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瓊脂糖電泳試驗(yàn)新方法及理論

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放大字體  縮小字體    發(fā)布日期:2021-03-22  來源:儀器網(wǎng)  作者:Mr liao  瀏覽次數(shù):69
核心提示:實(shí)驗(yàn)方法原理 瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳的主要區(qū)別是:它兼有 分子篩 和 電泳 的雙重作用。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),物質(zhì)分子通過時(shí)會(huì)受到阻力,大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大,因此在

實(shí)驗(yàn)方法原理

 

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳的主要區(qū)別是:它兼有 分子篩 和 電泳 的雙重作用。

瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),物質(zhì)分子通過時(shí)會(huì)受到阻力,大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大,因此在凝膠電泳中,帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量,而且還取決于分子大小,這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當(dāng)大,對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道,現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中。

蛋白質(zhì)和核酸會(huì)根據(jù)pH不同帶有不同電荷,在電場中受力大小不同,因此跑的速度不同,根據(jù)這個(gè)原理可將其分開。電泳緩沖液的pH在6~9之間,離子強(qiáng)度0.02~0.05適合。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100 bp的DNA/片段,其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低,但它制備容易,分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20 kb,利用脈沖電泳,可分離高達(dá)107 bp的DNA/片段。

DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷,在電場中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì),相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷,因此它們能以同樣的速率向正極方向移動(dòng)。

 

實(shí)驗(yàn)材料 DNA

 

試劑、試劑盒 瓊脂糖TBE電泳緩沖液電泳載樣緩沖液溴化乙錠(EB)溶液母液DNAGreen

 

儀器、耗材 水平式電泳裝置電泳儀臺(tái)式高速離心機(jī)恒溫水浴鍋微量移液槍微波爐或電爐紫外透射儀照相支架照相機(jī)及其附件

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

一、試劑配制

 

1. 5 TBE緩沖液:450 mmol/L Tris-硼酸,10 mmol/L EDTA,pH值8.0。使用時(shí)將上述儲(chǔ)存液稀釋10倍至0.5 TBE緩沖液,可同時(shí)作為電泳及制膠用的緩沖液。

 

二、制膠

 

1. 根椐制膠量及凝膠濃度,在加有一定量的電泳緩沖液的三角錐瓶中,加入準(zhǔn)確稱量的瓊脂糖粉(總液體量不宜超過錐瓶的50%

容量)。瓊脂糖粉末與0.5 TBE buffer的比例(w:v)參考表1,常用瓊脂糖濃度為0.7-1%。

瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的分辨范圍

2. 在錐瓶的瓶口上蓋上保鮮膜或牛皮紙,并在膜或紙上扎些小孔,然后在微波爐中加熱溶解瓊脂糖。加熱時(shí),當(dāng)溶液沸騰后,請(qǐng)戴上防熱手套,小心搖動(dòng)錐瓶,使瓊脂糖充分均勻溶解。此操作重復(fù)數(shù)次,直至瓊脂糖完全溶解。

 

3. 使溶液冷卻至50℃-60℃左右,如需要可在此時(shí)加入溴化乙錠溶液(終濃度0.5 g/ml)或按照1 L / 30 mL的比例加入DNAgreen染料,并充分混勻。

 

4. 將瓊脂糖溶液倒入制膠模中,然后在適當(dāng)位置處插上梳子。凝膠厚度一般在3~5 mm之間。制膠模如下圖所示,小膠倒入25-30 mL左右瓊脂糖溶液,大膠則60-70 mL左右,若需切膠回收,凝膠可適當(dāng)加厚。

 

5. 在室溫下使膠凝固,大約30分鐘~1小時(shí)。

三、上樣

 

1. 取適量樣品與6 上樣緩沖液混勻(如:1 l樣品與5 l 6 上樣緩沖液),用微量移液槍小心加入樣品槽中。

 

2. 上樣量根據(jù)樣品濃度可適當(dāng)調(diào)整,若DNA含量偏低,則可依上述比例增加上樣量,但總體積不可超過樣品槽容量(一般小孔40 l 為上限,大孔200 l 為上限,具體和制膠膜規(guī)格相關(guān))。

3. 每加完一個(gè)樣品要更換槍頭,以防止互相污染,注意上樣時(shí)要小心操作,避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。

 

四、電泳

 

1. 加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源。控制電壓保持在110 V,電流在40 mA以上。

 

2. 當(dāng)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2 cm時(shí)(約40 min),停止電泳。

 

3. 紫外下拍照并觀察。

 

注意事項(xiàng)

1. 5 TBE緩沖液放置時(shí)間過久會(huì)沉淀,因此一次性不要配太多。工作用電泳緩沖液為0.5 TBE緩沖液,取5 TBE緩沖液貯存液稀釋,現(xiàn)配現(xiàn)用。

 

2. 用于電泳的緩沖液和用于制膠的緩沖液必須統(tǒng)一。

 

3. 瓊脂糖粉在微波爐中加熱時(shí)間不宜過長,每次當(dāng)溶液起泡沸騰時(shí)停止加熱,否則會(huì)引起溶液過熱暴沸,造成瓊脂糖凝膠濃度不準(zhǔn),也會(huì)損壞微波爐。溶解瓊脂糖時(shí),必須保證瓊脂糖充分完全溶解,否則,會(huì)造成電泳圖像模糊不清。

 

4. 凝膠不立即使用時(shí),請(qǐng)用保鮮膜將凝膠包好后在4℃下保存,一般可保存2~5天。

 
關(guān)鍵詞: nbsp 瓊脂 瓊脂糖 電泳 凝膠
 
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