標(biāo)準(zhǔn)添加法
當(dāng)無法獲得空白試樣時(shí)，嬰幼兒配方奶粉中水溶性維生素的定量分析將通過標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行，(煙酰胺除外)*。在試樣中添加已知濃度(標(biāo)準(zhǔn)溶液)的分析溶液，使任何基質(zhì)效應(yīng)都可在校準(zhǔn)時(shí)消除。分析員最初并未知道試樣中分析物的含量，但可對(duì)加入的標(biāo)準(zhǔn)溶液的含量以及加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后儀器響應(yīng)的變化進(jìn)行追蹤。因此，通過校準(zhǔn)曲線外推法可測(cè)定試樣中分析物的濃度。實(shí)踐中，標(biāo)準(zhǔn)溶液的添加體積需保持在少量水平，以避免樣品基質(zhì)的稀釋。

*試樣基質(zhì)使用現(xiàn)有稀釋系數(shù)(見實(shí)驗(yàn)步驟)，無標(biāo)準(zhǔn)品添加，儀器對(duì)嬰幼兒配方奶粉中煙酰胺(B3)的響應(yīng)接近檢測(cè)器飽和值。如果標(biāo)準(zhǔn)添加法用于煙酰胺，將使檢測(cè)器達(dá)到飽和。

試樣準(zhǔn)備、萃取和標(biāo)準(zhǔn)添加
按嬰幼兒配方奶粉包裝說明上的三倍濃度進(jìn)行制備。

將10毫升嬰幼兒配方奶粉溶液放入用箔覆蓋的聚丙烯(PP)管中；加入20毫升100%濃度的乙醇。

搖晃混勻2分鐘，以3500 RPM的速率離心15分鐘。

上清液用0.45μmPVDF濾膜過濾。

將20μL上清液轉(zhuǎn)移至樣品瓶，加入10μL含11種分析物的已知標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液，樣品瓶加水至1毫升(將試樣基體中的分析物稀釋50倍；標(biāo)準(zhǔn)溶液中的分析物最終稀釋100倍)。

溶液中煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線單獨(dú)制備。

通過LC/MS/MS進(jìn)行分析。

采集和數(shù)據(jù)處理方法
通過MassLynx軟件v.4.1版本獲取數(shù)據(jù)，使用TargetLynx應(yīng)用管理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。
使用IntelliStart技術(shù)對(duì)12種目標(biāo)維生素進(jìn)行自動(dòng)MRM采集方法優(yōu)化。IntelliStart只需輸入復(fù)合物的基本信息，即可自動(dòng)找到母離子，優(yōu)化錐孔電壓，找到子離子并優(yōu)化碰撞能量。

每種維生素的2個(gè)MRM通道均已得到優(yōu)化；第一個(gè)通道為定量離子通道，第二個(gè)通道為定性離子通道。通道的駐留時(shí)間自動(dòng)得到優(yōu)化，每個(gè)色譜峰最少有12點(diǎn)以保證定量重現(xiàn)性。分析物的MRM通道、錐孔電壓、碰撞能量、以及保留時(shí)間詳見下表1。

表1. 檢測(cè)水溶性維生素的LC/MS/MS參數(shù)

除MRM數(shù)據(jù)外，使用Xevo TQ MS的RADAR模式可獲得全掃描數(shù)據(jù)。RADAR是一種可獲得豐富信息的采集方法，獲取MRM數(shù)據(jù)的同時(shí)可實(shí)時(shí)獲取試樣基質(zhì)的背景質(zhì)譜信息。使用RADAR不會(huì)影響MRM數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

結(jié)果與討論
ACQUITY UPLC系統(tǒng)結(jié)合Xevo TQ MS的ESI正離子模式成功分析了12種水溶性維生素。使用ACQUITY UPLC可在5分鐘內(nèi)快速分離所有分析物，包括1分鐘平衡時(shí)間，詳見圖1。

在同一分析檢測(cè)中，使用Xevo TQ MS的RADAR模式監(jiān)測(cè)嬰幼兒配方奶粉基質(zhì)中化合物的全掃描質(zhì)譜信息。RADAR利用Xevo TQ MS的快速采集速率獲取全掃描MS數(shù)據(jù)，且同時(shí)在MRM模式下得到足夠的分析物峰點(diǎn)數(shù)，以準(zhǔn)確定量和定性。

通過RADAR可觀察試樣基質(zhì)中的雜質(zhì)，并了解可能造成基質(zhì)效應(yīng)的化合物含量和類別。這對(duì)LC-MS/MS方法開發(fā)過程中優(yōu)化方法以降低基質(zhì)影響帶來幫助。例如，可通過調(diào)整分離方法使得目標(biāo)峰與可能引起基質(zhì)影響或離子抑制的區(qū)域分離。圖1中插入部分為從嬰幼兒配方奶粉試樣基質(zhì)全掃描數(shù)據(jù)中提取的質(zhì)譜圖。

?

此方法檢測(cè)了兩種不同大眾品牌的嬰幼兒配方奶粉。圖2顯示的是從其中一種品牌里提取的水溶性維生素定量離子色譜圖。

?

回收率與重現(xiàn)性
通過比較提取前加標(biāo)樣品和提取后加標(biāo)樣品得到回收率。實(shí)驗(yàn)分兩天檢測(cè)兩種不同品牌的嬰幼兒配方奶粉，每日重復(fù)進(jìn)行6次。
每種嬰幼兒配方奶粉的大部分化合物都達(dá)到了≥90%的提取回收率，吡哆醛、葉酸和核黃素-5’-磷酸除外，回收率相對(duì)較低的主要原因是上述物質(zhì)的水溶性較差。
盡管嬰幼兒配方奶粉是一種非常復(fù)雜的基質(zhì)，6個(gè)重復(fù)樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)仍然都低于5%。這顯示了該方法的高重現(xiàn)率以及穩(wěn)定性。

?

線性和定量
線性動(dòng)態(tài)范圍、靈敏度和適合性可通過標(biāo)準(zhǔn)添加法進(jìn)行評(píng)測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)添加法的一大優(yōu)勢(shì)是可避免測(cè)定基質(zhì)效應(yīng)，消除離子抑制的影響。
得到相關(guān)系數(shù)≥0.99的較好線性關(guān)系，如表3所示，所有進(jìn)行分析的嬰幼兒配方奶粉濃度范圍不同：抗壞血酸（C）為10 - 10000 ng/mL；氰鈷胺（B12）為0.1 - 10.0 ng/mL；其余分析物為1到100 ng/mL。數(shù)據(jù)3顯示的是以標(biāo)準(zhǔn)添加法為基準(zhǔn)的一種嬰兒配方奶粉抗壞血酸（C）和氰鈷胺（B12）的校正曲線。

?

圖3. 使用標(biāo)準(zhǔn)添加法的A配方奶粉的抗壞血酸和維生素B12 校正曲線。

校正曲線為外推法，由于考慮到稀釋因素(50 x)，x軸截距絕對(duì)值顯示嬰幼兒配方奶粉中分析物的濃度。Xevo TQ MS的靈敏度讓我們可稀釋樣本以降低基質(zhì)效應(yīng)，同時(shí)仍可檢測(cè)到目標(biāo)化合物。

?

結(jié)論
一個(gè)使用ACQUITY UPLC與Xevo TQ MS ESI正模式5分鐘快速測(cè)定法，用于同時(shí)分析12種水溶性復(fù)合維生素。此法替代了耗時(shí)的維生素單獨(dú)分析法。通過將不同維生素分析法融為一體，實(shí)驗(yàn)室可提高試樣分析量、減少容積消耗、降低運(yùn)作成本。
Xevo TQ MS的高靈敏度可實(shí)現(xiàn)在非常復(fù)雜的基質(zhì)中檢測(cè)低濃度目標(biāo)分析物(尤其是氰鈷胺)，如嬰幼兒配方奶粉。Xevo TQ MS可達(dá)到低定量限，稀釋試樣來降低基質(zhì)效應(yīng)。
RADAR技術(shù)可監(jiān)測(cè)基質(zhì)干擾，雜質(zhì)和樣品中的降解物，同時(shí)準(zhǔn)確定量目標(biāo)分析物。分析員在檢測(cè)基質(zhì)效應(yīng)時(shí)便可做出準(zhǔn)確決策，并可準(zhǔn)確評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)是否有存在。
IntelliStart技術(shù)簡(jiǎn)化系統(tǒng)準(zhǔn)備和MRM方法開發(fā)，確保所有層次的科學(xué)家均可快速準(zhǔn)確地操作儀器，生成最高質(zhì)量的可重現(xiàn)的UPLC/MS/MS數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)
1. AOAC Official Method 985.32, Microbiological Method for Analysis of Vitamin B6 (Pyridoxine, Pyridoxal, Pyridoxamine) in Ready-to-feed Milk-based Infant Formula.
2. AOAC Official Method 992.07, Microbiological Turbidimetric Method of Pantothenic Acid in Milk-based Infant Formula.