HO2 試劑盒；線(xiàn)蟲(chóng)氫過(guò)氧自由基 HO2 ELISA試劑盒

使用目的：

適用于檢測(cè)人動(dòng)植物組織勻漿、細(xì)胞上清、血清、血漿、尿液或其他相關(guān)生物液體中濃度。

HO2 試劑盒；線(xiàn)蟲(chóng)氫過(guò)氧自由基 HO2 ELISA試劑盒檢測(cè)原理：

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被抗體的微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。

HO2 試劑盒；線(xiàn)蟲(chóng)氫過(guò)氧自由基 HO2 ELISA試劑盒規(guī)格及配置：

名稱(chēng)

96孔配置

48孔配置

微孔酶標(biāo)板

12孔×8條

12孔×4條

標(biāo)準(zhǔn)品

0.3mL*6管

0.3mL*6管

樣本稀釋液

6mL

3mL

檢測(cè)抗體-HRP

10mL

5mL

20×洗滌緩沖液

25mL

15mL

底物A

6mL

3mL

底物B

6mL

3mL

終止液

6mL

3mL

封板膜

2張

2張

說(shuō)明書(shū)

1份

1份

自封袋

1個(gè)

1個(gè)

  自備物品：

①.酶標(biāo)儀（450nm）

②.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

③.37℃恒溫箱

HO2 試劑盒；線(xiàn)蟲(chóng)氫過(guò)氧自由基 HO2 ELISA試劑盒樣本的收集：

液體樣本的收集：

1、血清：用無(wú)菌管收集，室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

2、血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇 EDTA、肝素鈉或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。

3、尿液：用無(wú)菌管收集，2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

4、胸腹水：用無(wú)菌管收集，2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

5、腦脊液：用無(wú)菌管收集，2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

6、唾液：用無(wú)菌管收集，2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

7、細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

8、牛奶：用無(wú)菌管收集，2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

9、蜂蜜：用無(wú)菌管收集，2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

10、全血：用含有抗凝劑的無(wú)菌管收集，立即輕輕搖動(dòng)，來(lái)回輕輕顛倒數(shù)次，使血液和抗凝劑混勻，以防血液凝固。

固體樣本的收集 

1、組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱(chēng)取 1g 組織，加入 9ml 的 pH7.2-7.4 左右的 PBS，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清。分裝一 份待檢測(cè)，其余冷凍備用，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。對(duì)于植物組織，不好勻漿的話(huà)，就在液氮中充分研磨。

2、細(xì)胞內(nèi)蛋白樣本：許多待測(cè)蛋白不是分泌蛋白，而是存在于細(xì)胞內(nèi)的蛋白，這個(gè)時(shí)候，要先收集細(xì)胞，洗滌干凈，再破碎細(xì)胞，離心取上清。

（1）培養(yǎng)的細(xì)胞

A、動(dòng)物細(xì)胞：用 PH7.2-7.4 的 PBS 稀釋細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到 100 萬(wàn)/ml 左右。通過(guò)反復(fù)凍融（如果反復(fù)凍融，破碎效果不好，就采用超聲波破碎），以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

B、植物細(xì)胞：用 PH7.2-7.4 的 PBS 稀釋細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到 100 萬(wàn)/ml 左右，置于冰盒上，用超聲破碎儀，設(shè)置破碎 2s，冷卻 30s 的方式，充分破碎細(xì)胞，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

（2）組織的細(xì)胞

切割標(biāo)本后，稱(chēng)取 1g 組織，加入 9ml 的 pH7.2-7.4 左右的 PBS，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），去除上清，再用 pH7.2-7.4左右的 PBS 小心洗滌沉淀的細(xì)胞三遍。再用上述的細(xì)胞破碎方法破碎細(xì)胞。

3、細(xì)胞內(nèi)蛋白樣本：許多待測(cè)蛋白不是分泌蛋白，而是存在于細(xì)胞內(nèi)的蛋白，這個(gè)時(shí)候，要先收集細(xì)胞，洗滌干凈，再破碎細(xì)胞，離心取上清。

4、咽拭子：加入 2ml 的 pH7.2-7.4 左右的 PBS，溶解咽拭子頭部，搖勻，用鑷子取出咽拭子并擠干液體，2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清。分裝一份待檢測(cè)，其余冷凍備用，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。如果是測(cè)分泌蛋白，直接取上清檢測(cè)，測(cè)試細(xì)胞內(nèi)蛋白，要破碎細(xì)胞。

5、植物標(biāo)本：取組織塊（0.2g～0.5g）最少可到 5～10mg 在冰冷的 PBS 中漂洗，濾紙拭干，準(zhǔn)確稱(chēng)重，放入 5ml 的勻漿管中；按重量(mg):體積(ml)=1:9 的比例加入 9 倍體積的勻漿介質(zhì)于勻漿管中，冰水浴條件下,用眼科小剪盡快剪碎組織塊；勻漿的方式：手工勻漿，機(jī)器勻漿。 ① 手工勻漿：左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次（6～8 分鐘），充分研碎，制成 20%的勻漿液。 ② 機(jī)器勻漿：用組織搗碎機(jī) 10000～15000 轉(zhuǎn)/分 上下研磨制成 10%組織勻漿，也可用內(nèi)切式組織勻漿機(jī)制備（勻漿時(shí)間 10 秒/次，間隙 30 秒，連續(xù) 3～5 次，在冰水中進(jìn)行,可適當(dāng)延長(zhǎng)勻漿時(shí)間），鏡檢觀(guān)察:取少量組織勻漿作涂片（直接涂片、染色均可以），顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞是否破碎，若沒(méi)有則可延長(zhǎng)勻漿時(shí)間。將制備好的 10%勻漿液用普通離心機(jī)或低溫低速離心機(jī) 4000 轉(zhuǎn)/分左右,離心 10～15 分鐘，取上清液進(jìn)行測(cè)定。

HO2 試劑盒；線(xiàn)蟲(chóng)氫過(guò)氧自由基 HO2 ELISA試劑盒操作步驟：

①．從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

②．設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

③．樣本孔先加待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。

④．除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

⑤．棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次  （也可用洗板機(jī)洗板）。

⑥．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

⑦．每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。

結(jié)果判斷

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)，按曲線(xiàn)方程計(jì)算各樣本濃度值。

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