基于MALDI-TOF MS的具有劃時代意義的創(chuàng)新抗體技術(shù)

株式會社島津制作所田中最尖端研究所(所長：田中耕一，2002年諾貝爾化學(xué)獎得主;地址：京都市中京區(qū))的佐藤孝明課題小組與美國同行Daniel J. Capon在基礎(chǔ)技術(shù)開發(fā)取得了成功，他們共同研制出的抗體可將與抗原的結(jié)合能力提高一百倍以上。眾所周知，抗體作為一種蛋白質(zhì)，在生物疾病預(yù)防體系中的免疫反應(yīng)方面具有十分重要的作用。而在蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域，一種叫做“釣鉤”的新型技術(shù)已然開始使用，它可以從各種生化物質(zhì)的血液、細胞中選取某種特定的生化物質(zhì)，而且純度極高。在使用質(zhì)量分析儀器對蛋白質(zhì)進行結(jié)構(gòu)解析的時候，也可以在抗體中注入“釣鉤”，以便提高其靈敏度。但是就目前的形勢來看，在大部分注入“釣鉤”的抗體所生成的生化物質(zhì)、鼠?人嵌合抗體中，體現(xiàn)抗體模型結(jié)構(gòu)而投入使用的Y字型蝶狀連接(鉸鏈)卻幾乎毫無自由度可言，可以捕捉抗原的位置乃是一個“點”，與抗原相結(jié)合的能力受到了極大的限制。本課題研究小組在抗體的鉸鏈部插入了一個具備彈簧狀結(jié)構(gòu)的人工關(guān)節(jié)，它可以向抗原結(jié)合部提供“可變抗體”，使其自由度大幅度提高，并且確立了這種通過化學(xué)合成的抗體制作方法。通過以上操作，抗體與蛋白質(zhì)、縮氨酸等抗原的結(jié)合能力可以提高一百倍以上，課題小組在全世界最先確認了此項研究成果。通過這項技術(shù)，“釣鉤”功能有望大幅度提高，只要將“釣鉤”前處理方法與最尖端質(zhì)量分析儀器相結(jié)合，即可從一滴血中發(fā)現(xiàn)早期癌癥以及各種與生活習(xí)慣相關(guān)疾病的早期癥狀，從而對診斷體系的構(gòu)筑工程做出了劃時代的貢獻。不僅如此，它還可以作為抗體性藥物(將抗體本身用于制藥)來使用，有望在提高抗體性藥物的功能方面發(fā)揮作用，這種動態(tài)最近頗受關(guān)注。本項研究成果，將于2011年11月11日(星期五)在日本科學(xué)院英文學(xué)術(shù)雜志《Proceedings of the Japan Academy, Series B》網(wǎng)絡(luò)版上公開發(fā)表。

本項科研成果來源于下列課題：

最尖端研究開發(fā)支援(FIRST)計劃/日本學(xué)術(shù)振興會

課題名稱：《為下一代MALDI-TOF MS、藥品開發(fā)及診斷做出貢獻》

核心研究人員：田中耕一

研究時間： 2010年3月-2014年3月

日本科學(xué)振興機構(gòu)(JST)作為研究支援主管部分，在該計劃中發(fā)揮了應(yīng)有的作用。

〈研究背景及經(jīng)過〉

就世界范圍來看，體外診斷藥品市場規(guī)模如今已經(jīng)達到每年2兆2000億日元的水平，日本在市場占有率方面僅次于美國，大約為15%左右。其中，運用基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等“組學(xué)(Omics注釋3))”的生物標志物分子診斷市場近年來始終以兩位數(shù)的增長速度保持迅速發(fā)展之勢。最近，以美國為中心大型制藥企業(yè)，正在同時推進運用新型生物標志物的診斷器械體系以及新型藥劑的研制工作。本項研究課題乃是最尖端研究開發(fā)支援(FIRST)計劃中的一個課題，作為其中全球最高性能下一代MALDI-TOF MS開發(fā)中的一個環(huán)節(jié)，我們正在研究開發(fā)用于臨床檢體的蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)分析所必須的前處理方法。而當務(wù)之急就是研制出從各類大量存在的分子中，特別挑選出那些使用抗體的微量目標分子“釣鉤”(圖一)，我們的計劃是將下一代MALDI-TOF MS的全體靈敏度提高一萬倍以上，這是一種具有重大革新意義的前處理方法。

但是，目前投入使用的抗體普遍注入了生化體衍生物、生化關(guān)聯(lián)物質(zhì)，絕大部分在結(jié)構(gòu)方面多少發(fā)生了變化。在這種情況下，由于抗體的鉸鏈部幾乎毫無自由度可言，其抗原捕捉能力受到了極大限制。另外，在島津制作所，有關(guān)部門已經(jīng)在研制抗體磁珠設(shè)備注釋5)以及質(zhì)量分析儀器方面取得了成功。由于靈敏度依賴于目標分子的抗體結(jié)合能力，所以我們不打算墨守成規(guī)，而是希望開發(fā)一種具有劃時代意義的試管內(nèi)抗體合成法，以便獲得具有更高靈敏度的抗體。

〈研究內(nèi)容〉

在MALDI-TOF MS的幫助下，為了在生化試驗材料中高靈敏度、高效率地檢驗出縮氨酸，具有革新意義的前處理方法的開發(fā)無疑至關(guān)重要例如，為了對生化試驗材料中的目標肽進行濃縮，目前有一種使用單克隆抗體注釋6)的濃縮提純法可供借鑒，其特點就是可以鎖定磷酸化肽。另外，我們已經(jīng)開發(fā)出了諸多具有更加定量解析功能的方法，諸如可以使用穩(wěn)定同位素注釋7)來發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)并對其進行鑒別，還有差異性解析(對每個樣本進行數(shù)據(jù)解析)等等。而在這項課題研究中，我們將縮氨酸作為相當于(Y字型“V”部分)化學(xué)合成β-淀粉樣注釋8)的Fab抗體領(lǐng)域來加以使用，在它與由動物細胞生成的Fc領(lǐng)域(Y字型“I”部分)之間，注入了一個相當于人工關(guān)節(jié)功能、具有蝶狀結(jié)構(gòu)的非縮氨酸連接部(相當于鉸鏈部)，以便令其在試管中相結(jié)合。合成后的“β-淀粉樣非縮氨酸連接部/由動物細胞生成的Fc領(lǐng)域”就是所謂的合成化合物，使用質(zhì)量分析儀器(MALDI-TOF MS注釋9))即可對其結(jié)果進行確認。而且還可以對抗體是否具備“Fab領(lǐng)域/鉸鏈部/Fc領(lǐng)域”這種三結(jié)合抗體的化學(xué)結(jié)構(gòu)予以確認。隨后，我們運用表面等離子共振技術(shù)注釋10)對與β-淀粉樣進行特異集合的單克隆抗體結(jié)合部分進行查看，結(jié)果判明其結(jié)合能力取得了飛速增長(100倍以上)。通過增加鉸鏈部的自由度，可以在更加廣闊的“面”上捕捉抗原，從而使捕捉功率得以飛速提高。也就是說，我們以“抗體的鉸鏈部替換為非縮氨酸連接”作為手段，在全世界第一次成功地將抗體Fab領(lǐng)域/改變?yōu)榫哂猩鞆埿砸约案叨葟椥缘摹翱勺兛贵w”(圖二所示)。另外，其化學(xué)結(jié)構(gòu)可以憑借質(zhì)量分析儀器(MALDI-TOF-MS)得到明確的評估。

〈今后的發(fā)展計劃〉

本項研究成果，將來可以憑借使用新型“可變抗體”的前處理方法以及最尖端質(zhì)量分析儀器的技術(shù)組合，從一滴血中即可發(fā)現(xiàn)早期癌癥以及各種與生活習(xí)慣相關(guān)疾病的早期癥狀，從而對診斷體系的構(gòu)筑工程做出劃時代的貢獻。而且還可以作為抗體性藥物(將抗體本身用于制藥)來加以使用，有望在飛速提高抗體性藥物的功能方面發(fā)揮作用，這種動態(tài)最近頗受關(guān)注。

參考圖

抗體與抗原之間的關(guān)系如圖例“釣鉤”所示。也就是說，為了在數(shù)眾多的魚群(蛋白質(zhì)等化合物)中釣到目標的魚(抗原)，就必須使用特制的釣鉤及魚餌(抗原)。

圖一： “釣鉤”概念圖?

已知抗體(左側(cè))由于在鉸鏈部幾乎毫無自由度可言，捕捉抗原惟有通過“點”來作業(yè)。與此相對比，“可變抗體”(右側(cè))通過在鉸鏈部插入了一個蝶狀人工關(guān)節(jié)，能夠以鉸鏈部為頂點進行旋轉(zhuǎn)運動(或伸縮運動)，捕捉抗原可以在“面”上進行(立體)作業(yè)，因此捕捉效率得以飛速上升。

圖二 已知抗體與本課題研制成功的“可變抗體”之間的差異

術(shù)語解釋：

注釋1) 質(zhì)量分析儀器

從試驗材料中選出類似化合物并將其離子化，對其進行分離、檢測、測定、數(shù)據(jù)解析的儀器。

注釋2) 嵌合抗體

將人類抗體的可變部(接近Fab領(lǐng)域的前端的那一半)嵌入從老鼠身上提取的抗體。

注釋3) “組學(xué)”的詞尾

基因組學(xué)(遺傳基因解析)、蛋白質(zhì)組學(xué)(蛋白質(zhì)解析)、糖組學(xué)(糖基化解析)。代謝組學(xué)(細胞代謝解析)等的總稱。

注釋4) 生物標志物

通過對血液、尿液中的蛋白質(zhì)等物質(zhì)進行檢測來掌握疾病存在與否以及進展狀況的指標，又稱生物標記物。

注釋5)抗體磁珠

使抗體在磁珠(微粒子)表面進行結(jié)合、固化后的產(chǎn)物。利用目標分子與抗體結(jié)合后的抗體磁珠的特征(重力及磁力)，使它在離心力作用下下沉，再通過磁力的吸引作用，可以使目標分子高效率地聚集起來。

注釋6)單克隆抗體

由單一克隆細胞集群所產(chǎn)生、結(jié)構(gòu)單一的抗體。

注釋7)穩(wěn)定同位素

在物質(zhì)的構(gòu)成元素中雖然原子序數(shù)相同，但是“原子質(zhì)量不同”，這些原子被稱為同位素，其中半衰期基本保持不變的元素叫做穩(wěn)定同位素。

注釋8)β-淀粉樣

它是蛋白質(zhì)當中的一種，如若在腦內(nèi)大量堆積就會形成凝塊，我們通常稱之為“老人斑”。

由于在阿爾茨海默癥患者的腦部發(fā)現(xiàn)大量老人斑形成，所以目前醫(yī)界普遍認為其病因乃是蛋白質(zhì)。

注釋9)質(zhì)量分析儀器(MALDI-TOF MS)

將基質(zhì)輔助激光解吸電離技術(shù)(MALDI：Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)

與飛行時間質(zhì)譜(TOF-MS：Time Of Flight Mass Spectrometry)相結(jié)合，對質(zhì)量進行分析的儀器。MALDI如今已然成為生化高分子電離化的主要方法，其實就是本項最尖端開發(fā)支援計劃中核心研究者(田中耕一)所發(fā)明的軟電離質(zhì)譜技術(shù)(榮獲2002年度諾貝爾化學(xué)獎)的新發(fā)展。

注釋10)表面等離子共振技術(shù) (Surface Plasmon Resonance ：SPR)

金屬中電子與光會產(chǎn)生相互作用的現(xiàn)象。由于表面等離子會發(fā)生共振，所以表面上只要有極少量分子結(jié)合在一起，共振狀態(tài)就會敏感地發(fā)生變化。我們將這種檢驗原理應(yīng)用于生物感應(yīng)器，它的靈敏度極高，可以對微量蛋白質(zhì)進行檢驗。

論文名稱

《Flexible Antibodies with Nonprotein Hinges》 《非蛋白質(zhì)鉸鏈部的可變抗體》

[來源：科技日報] 新技術(shù)