Hongwei Xie, Weibin Chen, Martin Gilar, St John Skilton, and Jeffery R. Mazzeo
Waters Corporation, Milford, MA, U.S.

前言
??????? 流感是一種呼吸道病毒感染，它是美國主要的致死原因之一，每年有超過50,000人死于流感1。流感疫苗是一種主要的流感預防措施，也是降低季節(jié)性流感發(fā)病率和死亡率的主要策略。疫苗通過結合病毒血凝素（HA）抗體為人體提供保護，血凝素在流感感染中起到關鍵的作用。
?????? ?經(jīng)批準的季節(jié)性流感滅活疫苗通常含有規(guī)定量的HAs——H1、H3和B的混合物，對應3種最常見的病毒流感A亞型的H1N1和H3N2和流感B的HA蛋白。這些HA蛋白是糖蛋白類，每個糖基化位點均含有多種N-糖基化基序且每個位點含多種糖形。由于HAs在流感結合至宿主細胞，即感染過程中的重要決定作用，HAs中糖基化的精細鑒定和監(jiān)測對疫苗的開發(fā)和生產(chǎn)都非常重要。
????? ? 目前，N-糖基化鑒定方法包括釋放的游離聚糖分析2-4和完整質量分析5-7。這些方法對于分析含確定糖基化位點的糖蛋白類是有效的，如單克隆抗體。聚糖譜分析可在完整蛋白水平（完整質量分析）或作為碳水化合物（游離聚糖譜）進行。由于糖基化的天冬酰胺（N）殘基的質量在去糖基化時增加了1 Da，糖基化位點通?？捎山?jīng)酶（通常是PNGase F）去除聚糖部分后的肽譜來檢測。?
??????? 然而，這些方法很難區(qū)分同一蛋白不同糖基化位點上的聚糖分子，因此用這些方法表征含多個糖基化位點的糖蛋白，如HAs，是極富挑戰(zhàn)的。而且，如疫苗等復雜樣品均含有帶-NXS/T-基序的多個N糖基化位點。由于N位點修飾后1Da 質量增加可能是由其他位點糖基化或脫酰胺作用造成，通過肽譜確定N-鏈糖基化位點是非常困難的。
?????? 采用UPLC?革新的分離能力，經(jīng)由LC/UV-MS系統(tǒng)分析了單克隆鼠lgG1抗體胰蛋白酶消化所得胰蛋白酶肽的四種主要的N-糖形9。結果顯示該方法可檢測并量化糖基化。且采用該方法可同時鑒定糖基化位點和聚糖分子。
?????? 在以前的研究中10-11，我們證實采用UPLC/MSE獲得的胰蛋白酶肽譜能夠準確的分離和鑒定位點特異性修飾，如N-去氨酰作用和M-氧化。
?????? 在本應用實例中，我們證明UPLC/MSE可區(qū)分離并鑒定由昆蟲細胞-桿狀病毒重組表達系統(tǒng)（BEVS）表達的流感疫苗候選物HAs蛋白的N-糖基化。糖肽和糖形可由ACQUITY UPLC?系統(tǒng)在多肽水平分離，并由SYNAPT? MS系統(tǒng)在線檢測。UPLC/MSE數(shù)據(jù)經(jīng)BiopharmaLynx? 軟件處理并報告N-糖基化信息。該方法改進了表征質量并減少數(shù)據(jù)處理時間。此外，該方案有一個為非專業(yè)研究者提供了解決這類問題的通用流程，工作流程化可使整個團隊受益。

實驗
由昆蟲細胞BEVS系統(tǒng)表達的含有HA蛋白H1，H3和B的流感疫苗候選物經(jīng)胰蛋白酶消化。肽段混合物含有N-糖肽及來自于目的蛋白的其它肽段。制備的過程包括：
1. 蛋白溶解于0.05% RapiGest? SF、pH 7.4的溶液中，80 °C 加熱10 min變性
2. 56°C，DDT還原30 min
3. 黑暗，室溫下采用碘乙酰胺烷基化30 min
4. 37 °C，pH 7.4下，胰蛋白酶消化4 hrs
5. 加入0.1%甲酸終止反應，并滅活胰蛋白酶。
????? ?消化產(chǎn)物經(jīng)汗0.1%甲酸的5%乙腈（ACN）溶液稀釋成0.2 μg/μL，用于UPLC/MS分析。
?????? UPLC/MSE實驗采用ACQUITY UPLC-SYNAPT質譜偶聯(lián)系統(tǒng)分析。UPLC系統(tǒng)配置2.1 x 150 mm、BEH300 C18 1.7-μm肽分離柱。取20-μL含約4 μg肽混合物進樣，采用120-min 梯度洗脫（1至40% ACN0.1% FA溶液），流速0.2 mL/min，柱溫60 °C。重復進樣四次。
?????? 采用ESI陽離子模式獲得MSE 數(shù)據(jù)，低碰撞能（5 V）采集肽前體（MS）數(shù)據(jù)和提高能量（20-40V之間調整）獲得肽片段（MSE）數(shù)據(jù)。掃描時間為0.5秒（總工作周期1 sec）。分析中各種參數(shù)為：柱壓3.0 kV，源溫度100 °C，錐孔電壓 37 V，且錐孔氣流10 L/h。該系統(tǒng)調至最低分辨率10,000（V-模式），并采用100 fmol/μL Glu1-fibrinopeptide B（GFP）校正, GFP由含0.1% FA 50:50 ACN/水溶液配制，通過LOCKSPRAY通道每分鐘進樣一次以確保高質量準確度。?
?????? 采集的數(shù)據(jù)經(jīng)BiopharmaLynx, v. 1.2，MassLynx? 軟件的應用管理程序進行處理，采用strict tryptic cleavage rule，且設置cysteine carbamidomethylation為固定修飾，以及N-糖基化作為可變修飾。其它BiopharmaLynx 方法設置參照我們以前發(fā)表的文章。12

結果和討論
?????? 據(jù)報道，昆蟲細胞系表達的糖蛋白具有兩種主要的N-聚糖類型：少甘露糖苷結構（Man (1-3) GlcNAc2 or Man (1-3) GlcNAc[Fuc]GlcNAc）和寡聚甘露糖結構（Man(5-9)GlcNAc2），這里Man表示甘露糖，GlcNAc為N-乙酰葡糖胺，而Fuc是海藻糖。BiopharmaLynx含有11種可能的可變N-糖基化修飾糖形。HA 蛋白H1、H3和B的可能的N-糖基化位點（含-NXS/T基序）數(shù)目分別為9、12和10。對采集的UPLC/MSE數(shù)據(jù)經(jīng)BiopharmaLynx處理后，可分別判定H1、H3和B 7、4和6個N_糖基化位點。每個N_糖基化位點可能有多種連接的糖形。以下我們挑選出3個典型樣品（其中一個來自于疫苗樣本中的HA蛋白），以闡釋UPLC/MSE 是如何用于分離和表征糖肽和糖形。?
?????? 圖1顯示了HA蛋白B中糖基化和未糖基化的胰蛋白肽T8（分別命名為B_T8*和B_T8，在后面的文章中，所有的糖基化肽均采用型號（*）標記以表明相應的修飾形式）的分離和鑒定。
?????? 由于添加的糖基團增加了親水性，B_T8*洗脫較B_T8早（圖1A）。胰蛋白酶肽序列由MSE譜確定（圖1B和1C）。?
?????? B_T8*的糖基化由一系列低m/z 范圍的特征糖離子m/z 138.05，m/z 204.09，m/z 366.14和m/z 528.12展示，并由y28離子確證。y28糖基化修飾前后1038.36的質量變化與一種聚糖分子質量相對應（-Man3NAcGlc[Fuc]NAcGlc）。高m/z 范圍的糖基碎片離子可以給出所連接聚糖分子的進一步結構信息?；贐iopharmaLynx的質譜信號強度和前體物質的提取離子流色譜面積，B_T8*的相對濃度為 20%。

圖1. HA蛋白B 中糖基化和未糖基化胰蛋白酶肽段 T8的分離和鑒定

A) 前體的提取離子色譜
B) B_T8（未指定離子m/z 1199.65 和m/z 1023.5為在疫苗制劑的過程中加入的Twin-20碎片）的MSE譜
C) B_T8*MSE 譜

??????? 與B_T8*不同，大多數(shù)已經(jīng)鑒定的糖肽類是由多種糖形完全糖基化的，如HA蛋白H1肽段T24，未檢測出未修飾的H1_T24，但H1_T24*的四種修飾糖形經(jīng)層析法獲得分離和鑒定（圖 2A）。糖形的洗脫順序與聚糖的大小有關。聚糖越重，這種聚糖形的糖基化肽洗脫越早。該肽含有兩個N位點，但MSE 譜確定糖基化僅發(fā)生在含有-NSS-基序的N286，而含有-NVH-基序的N293則無糖基化修飾。這一現(xiàn)象與N-糖基化僅發(fā)生在含有-NXS/T-基序的N位點的定律一致。圖2B中顯示了H1_T24*-Man3NAcGlc2的MSE譜。同樣的，低m/z范圍的特征糖離子和高m/z范圍的糖基碎片離子進一步確認了糖基化并提供了聚糖分子的結構信息。?

圖2. HA蛋白H1中糖肽T24*的糖形的分離與鑒定
A) 前體的提取離子色譜
B) H1_T24*-Man3NAcGlc2 MSE 譜
# –特征糖離子?

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??????? 然而，并非所有已鑒定的糖形均可用層析法分離，如HA蛋白H3的胰蛋白酶肽T21中經(jīng)鑒定的5種糖形（見圖3A），但這些糖形在91.65 min 的同一個LC峰被洗脫。它們在提取離子色譜的保留時間僅有微小差異（~ 2秒）（數(shù)據(jù)未顯示）。這些證據(jù)和上述的例子表明糖形的色譜行為與聚糖連接的肽序列的性質有關。H3_T21的肽段序列和糖基化可由MSE 譜確定。圖3B中展示了一個H3_T21*-Man9NAcGlc2 MSE譜的例子。

圖3. HA蛋白H3中糖肽T21*糖形的分離和鑒定.
A） MS譜
B） H3_T21*-Man9NAcGlc2.的MSE譜
# – 特征糖離子

討論
??????? 本文的數(shù)據(jù)表明UPLC/MSE 可分離并鑒定流感疫苗樣品血凝素糖蛋白中多個糖肽及多種糖形。由于HA 蛋白有多個糖基化位點和多種糖形，傳統(tǒng)的方法如聚糖分析和完整質量分析很難勝任流感疫苗樣本糖基化的鑒定。
?????? 與傳統(tǒng)的糖基化鑒定方法不同，本研究中糖基化位點已采用MSE技術清晰的進行鑒定。MSE中的糖碎片離子的聚糖分子提供了有用的結構信息。此外，這些方法無需任何額外的富集或純化流程，獲得的數(shù)據(jù)可由BiopharmaLynx自動進行處理。
?????? 進一步的優(yōu)化可使得該方法不僅適用于復雜樣品，如流感疫苗的糖基化的鑒定，也可作為一種鑒定糖蛋白的快速和常規(guī)方法。

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