ACQUIT Y UPLC-ELSD測定奶粉和牛奶中八種糖的含量
趙淑軍 沃特世公司，上海，中國

關(guān)鍵詞：
超高效液相色譜 奶粉 牛奶 Fructose(果糖)Sorbose（山梨糖)
Glucose(葡萄糖)Sucrose(蔗糖)Maltose(麥芽糖)Lactose(乳糖)
Maltotriose(麥芽三糖) Maltotetraose(麥芽四糖)

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實(shí)驗(yàn)方法

材料、試劑和儀器
乙腈為色譜純，三乙胺為優(yōu)級純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水
(18MΩ,TOC3ppb)，ACQUITY UPLC?超高效液相色譜系統(tǒng)，Acquity
ELSD檢測器,(FILTER MIXER (425μl,P/N 205000403),可不用)。

色譜條件
液相系統(tǒng)： Waters ACQUITY UPLC?
配ACQUITY ELSD 蒸發(fā)光散射檢測器
色譜柱： AACQUITY UPLC BEH Amide 2.1mm x 100mm，
1.7 μm, P/N:186004801
柱溫： 35?C
分析時間 ： 18 min
進(jìn)樣量： 5ul(樣品進(jìn)樣2ul)
流動相： A:水
B:0.2%TEA乙腈溶液;梯度洗脫
弱洗溶劑： 乙腈/水=90/10，800μl
強(qiáng)洗溶劑： 乙腈/水=10/90，500μl
進(jìn)樣方式： 不充滿定量環(huán)（使用針溢出）
ELSD條件：
增益： 500
數(shù)據(jù)率： 10pps
噴霧器模式： 冷卻
漂移管溫度： 55?C
氣體壓力： 30psi
實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)溫度： 20?C
實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)濕度： 45%
工作電源： 220V穩(wěn)定電源
梯度方法見下表：
時間/(min) 流量/(ml/min) A% B% 曲線
0 0.15 15 85 初始
2 0.15 22 78 6
11 0.15 50 50 4
18 0.15 15 85 1

數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
Empower 2
前處理方法
稱取2.0 g奶粉樣品或5ml液態(tài)奶樣品，加入20mL(對于液態(tài)奶添加15ml)1/1的乙腈水溶液溶解，手搖震蕩混勻，然后渦旋混勻2分鐘，室溫下8000r/min離心15分鐘，取上清液過0.2μm濾膜；對于某些樣品由于糖含量很高，所以過濾后的樣品可能需要用乙腈/水=70/30的溶液稀釋一定倍數(shù)后，進(jìn)樣檢測。

結(jié)果與討論
標(biāo)準(zhǔn)配制
八種糖標(biāo)準(zhǔn)分別稱取10mg，用1/1的乙腈水定容至1ml，然后用乙腈/水=70/30的溶液稀釋配制各個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
八種糖UPLC分離檢測色譜圖及數(shù)據(jù)

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圖 1. 八種糖UPLC分離檢測色譜圖

圖1是八種糖50ppm混合標(biāo)準(zhǔn)品用UPLC(ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱)分離，ELSD檢測的色譜圖，按照保留時間順序分別是：Fructose(果糖)、Sorbose(山梨糖)、Glucose(葡萄糖)、Sucrose(蔗糖)、Maltose(麥芽糖)、Lactose(乳糖)、Maltotriose(麥芽三糖)、Maltotetraose(麥芽四糖)；包括5種單糖和3種多糖。有關(guān)數(shù)據(jù)見下表。

其中較難分離的Fructose(果糖)和Sorbose(山梨糖)、Maltose(麥芽糖)和Lactose(乳糖)均分別達(dá)到1.6、1.5的分離度。

方法的檢出限

如圖2所示，為5ppm的混標(biāo)色譜圖，此濃度下按保留時間順序八種糖的信噪比分別達(dá)到3、5、5、24、6、12、5和3，(進(jìn)樣量10ul）：

可見，八種糖中Fructose(果糖)、Sorbose(山梨糖)、Glucose(葡萄糖)、Maltose(麥芽糖)、Maltotriose(麥芽三糖)和Maltotetraose(麥芽四糖)的檢測限為5ppm；此濃度下Lactose(乳糖)可達(dá)到定量限，而Sucrose(蔗糖)的定量限可以到達(dá)2ppm。

方法的線性相關(guān)性

濃度分別為5.000、10.000、20.000、50.000、100.000、150.000mg/L的八種糖標(biāo)準(zhǔn)品依次進(jìn)樣，進(jìn)樣量均為5μL，外標(biāo)法定量。以峰面積A的lg值為縱坐標(biāo)，濃度C的lg值為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到8種糖的線性方程、復(fù)相關(guān)系數(shù)和線性曲線圖如圖3-圖10所示，在5.000-150.000 mg/L范圍8種糖均具有良好的lg-lg線性關(guān)系。

實(shí)際樣品檢測結(jié)果
從市場取某一奶粉樣品，進(jìn)行實(shí)際提取實(shí)驗(yàn)，進(jìn)樣檢測，色譜圖及結(jié)果數(shù)據(jù)見圖11所示，可以看出此樣品中含有蔗糖、乳糖、麥芽三糖和麥芽四糖四種糖成分，同時發(fā)現(xiàn)蔗糖和乳糖的含量相當(dāng)高，已經(jīng)超出檢測器的響應(yīng)范圍；因此將此樣品稀釋100倍后再次進(jìn)樣檢測，結(jié)果數(shù)據(jù)見圖12。

由圖11和12的數(shù)據(jù)可以知道此奶粉中含有蔗糖16.8mg/g、乳糖140.1 mg/g、麥芽三糖和麥芽四糖的含量分別只有1.9 mg/g、1.3mg/g。某液態(tài)奶提取后，稀釋100倍檢測結(jié)果見圖13。

重現(xiàn)性
首先用50ppm混合標(biāo)準(zhǔn)6次連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣，考察標(biāo)準(zhǔn)品在本方法下的穩(wěn)定性，見圖14所示重疊色譜圖，重復(fù)數(shù)據(jù)見表3、表4。

提取奶粉實(shí)際樣品，由于乳糖含量較高，將其稀釋了100倍，然后在不同天次連續(xù)3天進(jìn)樣檢測，考察本方法對于實(shí)際樣品日間的重現(xiàn)性情況，如圖15所示是該實(shí)際樣品3天內(nèi)3次進(jìn)樣的重疊色譜圖，由圖可見該方法對實(shí)際樣品在日間具有較好的重現(xiàn)性。

結(jié)論
本方法建立了用Waters UPLC-ELSD系統(tǒng)檢測奶粉和牛奶實(shí)際樣品中Fructose(果糖)、Sorbose(山梨糖)、Glucose(葡萄糖)、Sucrose(蔗糖)、Maltose(麥芽糖)、Lactose(乳糖)、Maltotriose(麥芽三糖)、Maltotetraose(麥芽四糖)8種常見糖的的定量分析方法。方法的檢出限:有6種糖達(dá)到5μg/g，另外兩種糖Sucrose和Lactose在5μg/g下的信噪比可達(dá)到24和12。使用ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱和三乙胺流動相體系，8種糖均實(shí)現(xiàn)基線分離，可以用于奶粉和牛奶中常見這8種糖的含量測定。

參考文獻(xiàn)：
Waters ACQUITY UPLC BEH Amide Columns Care & Use，P/N:715001371

[來源：沃特世科技（上海）有限公司(Waters)]