K599感受態(tài)細(xì)胞

K599 Chemically Competent Cell 產(chǎn)品說明書

產(chǎn)品規(guī)格 （CAT#: LM1080）
K599 Competent Cell：                                            100μl/支
pCAMBIA2301(control vector, 10ng/μl)                        10μl
保存條件(保質(zhì)期)：                                        -80℃（12個月）

K599感受態(tài)細(xì)胞基因型

 Agrobacterium rhizogenes (strR ) pRi2659 (agropine type)

K599感受態(tài)細(xì)胞產(chǎn)品說明

發(fā)根農(nóng)桿菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)農(nóng)桿菌屬(agrobacterium)的一種革蘭氏陰性土壤細(xì)菌，它能夠感染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物以及個別裸子植物。K599發(fā)根農(nóng)桿菌（NCPPB2659）含有pRi2659農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒，具有廣泛的宿主范圍（葫蘆科，豆科，茄科等），同時具有鏈霉素抗性。本公司生產(chǎn)的K599化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pCAMBIA2301質(zhì)粒（卡那霉素抗性）檢測，轉(zhuǎn)化效率 103 cfu/μg DNA。

K599感受態(tài)細(xì)胞常規(guī)操作方法

1.取-80℃保存的K599發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)于室溫或手心片刻待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時插入冰中。

2.  每100μl感受態(tài)加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA（轉(zhuǎn)化效率較高，第一次使用前最好做預(yù)實驗確定所加質(zhì)粒的量），用手快速、劇烈撥打管底混勻或用槍吹吸混勻，依次放于冰中靜置5分鐘、液氮5分鐘、37℃水浴5分鐘、冰浴5分鐘。

3. 冰浴中拿出放室溫，加入700μl 無抗生素的TY液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)2小時。

4. 6000 rpm 離心一分鐘收菌，留取 100 μl 左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的 TY平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3 天

● 農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方：

 抗生素

 配方

  原液

  工作液

  羧芐青霉素 (carb)

  雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌

 50 mg/ml

 50 μg/ml

 硫酸卡那霉素 (kan)

  雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌

 50 mg/ml

 50 μg/ml

  鏈霉素 (strep)

  雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌

 10 mg/ml

 50 μg/ml

 利福平 (rif)

 DMSO溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌

 10 mg/ml

 20 μg/ml

  慶大霉素 (gent)

  雙蒸水溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌 

 20 mg/ml

 40 μg/ml

  氯霉素（cam）

  無水乙醇溶解，0.22 μm濾膜過濾除菌

 34 mg/ml

 34 ug/ml

常用農(nóng)桿菌抗性： (R：抗；S：敏感。)

農(nóng)桿菌菌株

羧芐青霉素(carb)

鏈霉素(strep)

利福平(rif)

氯霉素(gent)

硫酸卡那霉素(kan)

Ar.A4

S

S

S

S

R

MSU440

S

R

S

S

S

Ar.Qual

S

R

S

R

S

C58C1

S

R

R

S

S

ATCC15834

S

S

S

S

S

K599

S

R

S

S

S

Ar.1193

R

R

R

S

S

● TY配方（1L）：

Tryptone                5g

Yeast extract  3g

補水到1L體積，完全溶解后，121度、20分鐘高溫滅菌

配制1M的氯化鈣水溶液，121度、20分鐘高溫滅菌

每1L 滅菌的TY液體營養(yǎng)液中加入10ml 無菌的1M氯化鈣水溶液即可。

若配制TY固體培養(yǎng)基，則加入15g 瓊脂粉。

注意事項

1. 加入質(zhì)粒時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。

2. 混勻質(zhì)粒時應(yīng)用手指快速撥打管底或用槍吹吸混勻，務(wù)必使質(zhì)粒快速、均勻分散開，與感受態(tài)細(xì)胞充分接觸。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢，菌落變小，為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量或降低涂板的菌量。

4.  K599具有鏈霉素抗性，不可用于具有鏈霉素抗性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。

同一批感受態(tài)細(xì)胞，用含目的片段的T載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化（陽性對照）能長出密密麻麻的菌落，而用另一種載體和目的片段的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，卻一個菌都沒長出來，重復(fù)了三次都這樣。請問這是感受態(tài)細(xì)胞的制作不過關(guān)，還是連接出了問題？哪個可能性大些？

答：應(yīng)該是連接的問題。所有連接反應(yīng)建議同時轉(zhuǎn)化酶切后的質(zhì)粒作為另一個陰性對照，確定酶切是否完全。同時連接前請確定質(zhì)粒和片段濃度達(dá)到最小連接量的要求。

感受態(tài)細(xì)胞放到-80冰箱了有半年了，還能用來轉(zhuǎn)化質(zhì)粒嗎？

答：如-80冰箱儲存過程中沒有發(fā)生凍融的情況，是可以用來轉(zhuǎn)化的，但是由于凍存時間過長，轉(zhuǎn)化效率會有所下降，如果用于普通的質(zhì)粒重轉(zhuǎn)或TA克隆等高效連接體系也是可以的，如珍貴的樣品請選用較為新鮮的感受態(tài)細(xì)胞。