1、范圍：適用于化妝品原料及其產(chǎn)品的基因突變檢測。

  2  定義

  2.1 回復(fù)突變 reverse mutation

細(xì)菌在化學(xué)致突變物作用下由營養(yǎng)缺陷型回變到原養(yǎng)型(prototroph)。

  2.2 基因突變 gene mutation

在化學(xué)致突變物作用下細(xì)胞DNA中堿基對的排列順序發(fā)生變化。

  2.3 堿基置換突變 base substitution mutation

引起DNA鏈上一個或幾個堿基對的置換。

堿基置換有轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transversion)兩種形式。

轉(zhuǎn)換是DNA鏈上的一個嘧啶被另一嘧啶所替代，或一個嘌呤被另一嘌呤所代替。

顛換是DNA鏈上的一個嘧啶被另一嘌呤所替代，或一個嘌呤被另一嘧啶所代替。

  2.4 移碼突變 frameshift mutation

引起DNA鏈上增加或缺失一個或多個堿基對。

  2.5 細(xì)菌回復(fù)突變試驗bacterial reverse mutation assay

利用一組組氨酸或者色氨酸缺陷型試驗菌株測定引起細(xì)菌堿基置換或移碼突變的化學(xué)物質(zhì)所誘發(fā)的氨基酸缺陷型 原養(yǎng)型回復(fù)突變的試驗方法。

  2.6 S9

經(jīng)多氯聯(lián)苯(PCB混合物)或C12H12N2O3鈉和 -萘黃酮結(jié)合誘導(dǎo)的大鼠制備肝勻漿，在9000g下離心10min后的肝勻漿上清液。

  3  原理

鼠傷寒沙門氏組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長；大腸桿菌色氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株不能合成色氨酸，故在缺乏色氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長。假如有致突變物存在，則營養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌回復(fù)突變成原養(yǎng)型，因而能生長形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。

某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復(fù)突變，故需加入經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠肝制備的S9混合液。

  4  儀器和設(shè)備

電熱恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱烤箱、低溫冰箱（－80℃）或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混勻振蕩器、勻漿器、菌落計數(shù)器、低溫高速離心機(jī)，玻璃器皿、生物安全柜等。

  5  培養(yǎng)基和試劑

  5.1 0.5mmol/L組氨酸－0.5mmol/L色氨酸－0.5mmol/L生物素溶液

成分：

L-組氨酸（MW155）

78mg

D-生物素（MW244）

122mg

L-色氨酸（MW204）

102mg

加蒸餾水/去離子水至

1000mL

配制：將上述成分加熱，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高壓滅菌20min。貯于4℃冰箱。若試驗中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸。

  5.2 頂層瓊脂培養(yǎng)基

成分：

瓊脂粉

1.2g

氯化鈉

1.0g

加蒸餾水/去離子水至

200mL

配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。實驗時，加入0.5mmol/L組氨酸－0.5mmol/L色氨酸－0.5mmol/L生物素溶液20mL。若試驗中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸。

  5.3 Vogel-Bonner(V-B)培養(yǎng)基E

成分：

枸櫞酸(C6H8O7 H2O)

100g

磷酸氫二鉀(K2HPO4)

500g

磷酸氫銨鈉(NaNH4HPO4 4H2O)

175g

硫酸鎂(MgSO4 7H2O)

10g

加蒸餾水/去離子水至

1000mL

配制：先將前三種成分加熱溶解后，再將溶解的硫酸鎂緩緩倒入容量瓶中，加蒸餾水/去離子水至1000mL。于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。

  5.4 20%葡萄糖溶液

成分：

葡萄糖

200g

加蒸餾水/去離子水至

1000mL

配制：加少量蒸餾水/去離子水加溫溶解葡萄糖，再加蒸餾水/去離子水至1000mL。于0.068MPa下高壓滅菌20min。儲于4℃冰箱。

  5.5 底層瓊脂培養(yǎng)基

成分：

瓊脂粉

7.5g

蒸餾水/去離子水

480mL

V-B培養(yǎng)基E

10mL

20%葡萄糖溶液

10mL

配制：首先將前兩種成分于0.103MPa下高壓滅菌30min后，再加入后兩種成分，充分混勻倒底層平板。按每皿25mL制備平板，冷凝固化后倒置于電熱恒溫培養(yǎng)箱中24h，備用。

  5.6 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基

成分：

:C8H9Cl

2.5g

胰胨

5.0g

磷酸氫二鉀(K2HPO4)

1.0g

加蒸餾水/去離子水至

500mL

配制：將上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。

  5.7 鹽溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2)

成分：

(KCl)

61.5g

KCl

氯化鎂(MgCl2 6H2O)

40.7g

加蒸餾水/去離子水至

500mL

配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。

  5.8 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)

成分：

磷酸二氫鈉(NaH2PO4 2H2O)

2.965g

磷酸氫二鈉(Na2HPO4 12H2O)

29.015g

加蒸餾水/去離子水至

500mL

配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲于4℃冰箱。

  5.9 S9混合液

成分：

每毫升S9混合液

肝S9

100 l

鹽溶液

20 l

滅菌蒸餾水/去離子水

380 l

0.2mol/L磷酸鹽緩沖液

500 l

輔酶II(NADP)

4 mol

6-磷酸葡萄糖(G-6-P)

5 mol

配制：將輔酶II和6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶內(nèi)稱重，然后按上述相反的次序加入各種成分，使肝S9加到已有緩沖液的溶液中。該混合液必須臨用現(xiàn)配，并保存于冰水浴中。實驗結(jié)束，剩余S9混合液應(yīng)該丟棄。

  5.10 菌株鑒定用和特殊用途試劑

  5.10.1 組氨酸-色氨酸-生物素平板

成分：

瓊脂粉

15g

蒸餾水/去離子水

934mL

(V-B)培養(yǎng)基E

20mL

20%葡萄糖

20mL

滅菌鹽酸組氨酸水溶液(0.5g/100mL)

10mL

滅菌鹽酸色氨酸水溶液(0.5g/100mL)

10mL

滅菌0.5mmol/L生物素溶液

6mL

配制：高壓滅菌瓊脂和水后，將滅菌20%葡萄糖，V-B培養(yǎng)基、組氨酸溶液，加進(jìn)熱的瓊脂溶液中（若試驗中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸，同時蒸餾水/去離子水改為944mL）。待溶液稍微冷卻后，加入滅菌生物素，混勻，澆制平板。

  5.10.2 氨芐青霉素平板和氨芐青霉素/四環(huán)素平板

成分：

瓊脂粉

15g

蒸餾水/去離子水

930mL

(V-B)鹽溶液

20mL

20%葡萄糖

20mL

滅菌鹽酸組氨酸溶液（0.5g/100mL）

10mL

滅菌鹽酸色氨酸水溶液(0.5g/100mL)

10mL

滅菌0.5mmol/L生物素溶液

6mL

氨芐青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/L NaOH中)

3.15mL

四環(huán)素溶液(8mg/mL于0.02mol/L HCl中)

0.25mL

配制：瓊脂和水高壓滅菌20min，將無菌的葡萄糖、VB鹽溶液、組氨酸溶液和色氨酸溶液，加進(jìn)熱的瓊脂溶液中，混勻（若試驗中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸，同時蒸餾水/去離子水改為加940mL）。冷卻至大約50℃，無菌條件下加入四環(huán)素溶液和/或氨芐青霉素溶液。

應(yīng)該在傾注瓊脂平板后幾天內(nèi)，制備主平板。

  5.10.3 營養(yǎng)瓊脂平板

成分：

瓊脂粉

7.5g

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基

500mL

配制：于0.103MPa下高壓滅菌30min后傾注平板。

  6  試驗菌株及其生物學(xué)特性鑒定

  6.1 試驗菌株

采用以下菌株作為標(biāo)準(zhǔn)組合：

鼠傷寒沙門氏菌TA1535；

鼠傷寒沙門氏菌TA97或TA97a或TA1537；

鼠傷寒沙門氏菌TA98；

鼠傷寒沙門氏菌TA100；

鼠傷寒沙門氏菌TA102或大腸桿菌WP2uvrA或大腸桿菌WP2uvrA（pKM101）；

  6.2 生物學(xué)特性鑒定

新獲得的或長期保存的菌種，在試驗前必須進(jìn)行菌株的生物特性鑒定。菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)，如表1所示。

表1 試驗菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)

菌株

組氨酸缺陷

色氨酸缺陷

脂多糖屏障缺損

氨芐青霉素抗性

切除修復(fù)缺損

四環(huán)素

抗性

自發(fā)回變菌落參考數(shù)*

Ames實驗室

Zeiger實驗室

TA97

+

/

+

+

+

-

90~180*

75~200*

TA97a

+

/

+

+

+

-

90~180*

75~200*

TA98

+

/

+

+

+

-

30~50

20~50

TA100

+

/

+

+

+

-

100~200

75~200

TA102

+

/

+

+

-

+

240~320*

100~400*

TA1535

+

/

+

-

+

-

10~35

5~20

TA1537

+

/

+

-

+

-

3~15

5~20

WP2uvrA

/

+

/

-

+

-

/

5~20

WP2uvrA（pKM101）

/

+

/

+

+

-

/

100~200

注

+ 表示需要組氨酸

+ 表示需要色氨酸

+ 表示具有rfa突變

+ 表示具有R因子

+ 表示對于鼠傷寒沙門氏菌具有△uvrB突變，對于大腸桿菌，具有△uvrA突變

+ 表示具有pAQ1質(zhì)粒

*在體外代謝活化條件下自發(fā)回變菌

落數(shù)略增。

對于各菌的自發(fā)回變范圍，各個實驗室在參考其他實驗室數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上應(yīng)建立自己的歷史對照數(shù)據(jù)庫，形成適合本實驗室條件的適用范圍。同時，實驗室背景數(shù)據(jù)應(yīng)當(dāng)與文獻(xiàn)報道相符。

  6.2.1 組氨酸缺陷/色氨酸缺陷

原理：組氨酸缺陷型試驗菌株本身不能合成組氨酸，只能在補(bǔ)充組氨酸的培養(yǎng)基上生長，而在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，則不能生長。

色氨酸缺陷試驗菌株本身不能合成色氨酸，只能在補(bǔ)充色氨酸的培養(yǎng)基上生長，而在缺乏色氨酸的培養(yǎng)基上，則不能生長。

鑒定方法：將測試菌株增菌液分別于含組氨酸或者色氨酸培養(yǎng)基平板和無組氨酸或者色氨酸平板上劃線，于37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷：組氨酸缺陷型菌株在含組氨酸平板上生長，而在無組氨酸平板上則不能生長；色氨酸缺陷型菌株在含色氨酸平板上生長，而在無色氨酸平板上則不能生長。

  6.2.2 脂多糖屏障缺損

原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一層脂多糖屏障缺損，因此一些大分子物質(zhì),如結(jié)晶紫能穿透菌膜進(jìn)入菌體，從而抑制其生長，而野生型菌株則不受其影響。

鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，然后將浸濕的0.1%結(jié)晶紫溶液濾紙條與劃線處交叉放置。37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷：假若待測菌在濾紙條與劃線交叉處出現(xiàn)一透明菌帶，說明該待測菌株具有rfa突變。

  6.2.3 氨芐青霉素抗性

原理：含R因子的試驗菌株對氨芐青霉素有抗性。因為R因子不太穩(wěn)定，容易丟失，故用氨芐青霉素確定該質(zhì)粒存在與否。

鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL，在氨芐青霉素平板上劃線，37℃下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷；假若測試菌在氨芐青霉素平板上生長，說明該測試菌具有抗氨芐青霉素作用，表示含R因子，否則，表示測試菌不含R因子或R因子丟失。

      6.2.4 紫外線敏感性

原理：具有△uvrB/A突變的菌株對紫外線敏感，當(dāng)受到紫外線照射后，不能生長，而具有野生型切除修復(fù)酶的菌株，則能照常生長。

鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，用黑紙蓋住平板的一半，置紫外燈下照射（15W，距離33cm）8秒鐘。置37℃下孵育24h后觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷：具有△uvrB/A突變的菌株對紫外線敏感，經(jīng)輻射后細(xì)菌不生長，而具有完整地切除修復(fù)系統(tǒng)的菌株，則照常生長。

  6.2.5 四環(huán)素抗性

原理：具有pAQI的菌株對四環(huán)素有抗性。

鑒定方法：吸取待測菌株增菌液0.1mL于氨芐青霉素/四環(huán)素平板上劃線，置37℃下孵育24h后觀察結(jié)果。

結(jié)果判斷：假若測試菌照常在氨芐青霉素/四環(huán)素平板上生長，表明該測試菌株對氨芐青霉素和四環(huán)素兩者有抗性，具有pAQI質(zhì)粒，否則，說明測試菌株不含pAQI質(zhì)粒。

  6.2.6 自發(fā)回變

原理：每種試驗菌株都以一定的頻率自發(fā)地產(chǎn)生回變，稱為自發(fā)回變。這種自發(fā)回變是每種試驗菌株的一項特性。

鑒定方法：將待測菌株增菌液0.1mL加到2mL含組氨酸-色氨酸-生物素的頂層瓊脂培養(yǎng)基的試管內(nèi)（若試驗中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸），混勻后鋪到于底層瓊脂平板上，待瓊脂固化后，置37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中孵育48 72h后記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。

結(jié)果判斷：每種標(biāo)準(zhǔn)測試菌株的自發(fā)回變菌落數(shù)應(yīng)符合表1要求。經(jīng)體外代謝活化后的自發(fā)回變菌落數(shù)，要比直接作用下的略高。

  6.2.7 回變特性-診斷性試驗

原理：每種試驗菌株對診斷性誘變劑回變作用的性質(zhì)以及S9混合液的效應(yīng)不一。

鑒定方法：按照平板摻入試驗的操作步驟進(jìn)行。將受試物換成診斷性誘變劑。

結(jié)果判斷：標(biāo)準(zhǔn)菌株對某些診斷性誘變劑特有的回變結(jié)果參見表2。

  表2 測試菌株的回變性

誘變劑

劑量( g/皿)

S9

TA97

TA98

TA100

TA102

TA1535

TA1537

WP2uvrA

WP2uvrA（pKM101）

柔毛霉素

6.0

-

124

3123

47

592

/

/

/

/

 N3Na 

1.5

-

76

3

3000

188

320(0.5 g)

/

/

/

ICR-191

1.0

-

1640

63

185

0

/

/

/

/

鏈霉黑素

0.25

-

inh

inh

inh

2230

/

/

/

/

MitomycinC

0.5

-

inh

inh

inh

2772

/

/

/

/

2,4,7-三硝基-9-芴酮

0.20

-

8377

8244

400

16

/

/

/

/

4-硝基-O-次苯二胺

20

-

2160

1599

798

0

/

/

/

/

4-硝基喹啉-N-氧化物

0.5

-

528

292

4220

287

/

/

610

/

甲基磺酸甲酯

1.0( l)

-

174

23

2730

6586

/

/

/

/

C8H10N3NaO3S

50.0

-

2688

1198

183

895

/

/

/

/

9-氨基吖啶

50

-

/

/

/

/

/

337

/

/

2-氨基芴

10

+

1742

6194

3026

261

/

/

/

/

苯并（a）芘

1.0

+

337

143

937

255

/

110(5 g)

/

/

2-氨基蒽

20

+

/

/

/

/

380(5 g)

/

300

/

注：inh表示抑菌。

  7  大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)和S9的制備

  7.1 誘導(dǎo)

選擇健康雄性成年大鼠，體重200g左右。將多氯聯(lián)苯（PCB混合物）溶于玉米油中，濃度為200mg/mL，按500mg/kg體重一次腹腔注射，5d后處死動物，處死前禁食12h。

也可采用C12H12N2O3鈉和 -萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)的方法進(jìn)行制備。經(jīng)口或腹腔注射給予80mg/kgC12H12N2O3鈉和80mg/kg -萘黃酮，連續(xù)3天，處死前禁食16h。

  7.2 S9制備

首先，用75%酒精消毒動物皮毛，剖開腹部。在無菌條件下，取出肝臟，去除肝臟的結(jié)締組織，用冰浴的0.15mol/LKCl溶液淋洗肝臟，放入盛有0.15mol/LKCl溶液的燒杯里。按每克肝臟加入0.15mol/LKCl溶液3mL。用電動勻漿器制成肝勻漿，再在低溫高速離心機(jī)上，在4℃條件下，以9000g離心10min，取其上清液（S9）分裝于塑料管中。每管裝2mL 3mL。儲存于液氮生物容器中或－80℃冰箱中備用。

上述全部操作均在冰水浴中和無菌條件下進(jìn)行。制備肝S9所用一切手術(shù)器械、器皿等，均經(jīng)滅菌消毒。S9制備后，其活力需經(jīng)診斷性誘變劑進(jìn)行鑒定。

  8  溶劑的選擇

如果受試物為水溶性，可用滅菌蒸餾水/去離子水作為溶劑；如為脂溶性，應(yīng)選擇對試驗菌株毒性低且無致突變性的有機(jī)溶劑，常用的有二甲基亞砜（DMSO）、丙酮、95%乙醇。一般操作中，為了減少誤差和溶劑的影響，常按每皿使用劑量用同一溶劑配成不同的濃度，固定加入量為100 l。

  9  劑量的設(shè)計

決定受試物MAX高劑量的標(biāo)準(zhǔn)是對細(xì)菌的毒性及其溶解度。自發(fā)回變數(shù)的減少，背景菌變得清晰或被處理的培養(yǎng)物細(xì)菌存活數(shù)減少，都是毒性的標(biāo)志。

對原料而言，一般MAX高劑量組可為5mg/皿或5 l/皿。對產(chǎn)品而言，有殺菌作用的受試物，MAX高劑量可為MAX低抑菌濃度，無殺菌作用的受試物，MAX高劑量可為原液。受試物至少應(yīng)設(shè)四個劑量組。每個劑量均做三個平行平板。

  10  試驗操作步驟

  10.1 增菌培養(yǎng)

取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5mL，加入無菌試管中，將主平板或冷凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩（100次/min）培養(yǎng)10h。該菌株培養(yǎng)物應(yīng)每毫升不少于1-2 109活菌數(shù)。

  10.2 平板摻入法

實驗時，將含0.5mmol/L組氨酸－0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L生物素溶液（若試驗中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸）的頂層瓊脂培養(yǎng)基2.0mL分裝于試管中，45℃水浴中保溫，然后每管依次加入試驗菌株增菌液0.1mL，受試物溶液0.1mL和磷酸鹽緩沖液0.5mL或者S9混合液0.5mL（需代謝活化時），充分混勻，迅速傾入底層瓊脂平板上，轉(zhuǎn)動平板，使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后，倒置于37℃培養(yǎng)箱里孵育48 72h。記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。

實驗中，除設(shè)受試物各劑量組外，還應(yīng)同時設(shè)空白對照、溶劑對照、陽性誘變劑對照和無菌對照。

  11  數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷

記錄受試物各劑量組、空白對照（自發(fā)回變）、溶劑對照以及陽性誘變劑對照的每皿回變菌落數(shù)，并求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

如果受試物TA1535、TA1537、WP2uvrA的回變菌落數(shù)是溶劑對照回變菌落數(shù)的三倍或三倍以上，受試物TA97、TA97a、TA98、TA100、TA102、WP2uvrA（pKM101）的回變菌落數(shù)是溶劑對照回變菌落數(shù)的二倍或二倍以上，并出現(xiàn)以下情形之一，則該受試物判定為致突變陽性，

（1）呈劑量-反應(yīng)關(guān)系

（2）任何一個劑量條件下，出現(xiàn)陽性反應(yīng)并有可重復(fù)性

受試物經(jīng)上述五個試驗菌株測定后，只要有一個試驗菌株，無論在加S9或未加S9條件下為陽性，均可報告該受試物細(xì)菌回復(fù)突變試驗為致突變陽性。如果受試物經(jīng)五個試驗菌株檢測后，無論加S9和未加S9均為陰性，則可報告該受試物為致突變陰性。

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