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粒細(xì)胞分類法枚舉參看新方法vs91化學(xué)工業(yè)儀器網(wǎng)

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放大字體  縮小字體    發(fā)布日期:2021-01-26  來源:儀器網(wǎng)  作者:Mr liao  瀏覽次數(shù):77
核心提示:白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)參考方法 Reference leukocyte differential count method 前    言  為了保證白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果具有溯源性和準(zhǔn)確性,

白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)參考方法 
Reference leukocyte differential count method 


前    言 
 
為了保證白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果具有溯源性和準(zhǔn)確性,特制定本標(biāo)準(zhǔn)。

本標(biāo)準(zhǔn)修改采用了美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)頒發(fā)的《白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)參考方法和儀器評(píng)價(jià)方法》標(biāo)準(zhǔn)(H20-A)。 

本標(biāo)準(zhǔn)從20XX年XX月XX日起實(shí)施。 

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B和附錄C都是規(guī)范性附錄。 

本標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部醫(yī)政司提出。 

本標(biāo)準(zhǔn)由上海市臨床檢驗(yàn)中心負(fù)責(zé)起草。 

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:胡曉波、許蕾、宋穎、方心馳、張錦鋒。 本標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部委托衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心負(fù)責(zé)解釋。

1 范圍 
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了建立白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)參考方法中有關(guān)樣本采集、血涂片制備的要求、血涂片染色、血涂片有核細(xì)胞檢查的步驟、對(duì)檢驗(yàn)人員的要求和考核等內(nèi)容。 
本標(biāo)準(zhǔn)適用于建立的實(shí)驗(yàn)室

2 總則 

2.1 本標(biāo)準(zhǔn)采用手工目視顯微鏡計(jì)數(shù)法作為白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的參考方法。 

2.2 為了保證參考方法檢測(cè)結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確性,建立參考方法的實(shí)驗(yàn)室必須進(jìn)行比對(duì)。 

3 方法 

3.1 樣本采集 
將靜脈血采集于EDTA-K2抗凝劑(液體或粉末狀)中(濃度為每毫升血液含1.5~2.2mg EDTA-K2 H2O)。采血后立即混勻,應(yīng)拒絕分析有肉眼可見凝塊的樣本。 

3.2 血涂片制備和要求

3.2.1 血涂片制備 

3.2.1.1 每份樣本制作3張血涂片。要求所用玻片清潔、干燥、無塵,大小為25 mm 75mm,厚度為0.8~1.2mm。并有明確標(biāo)記。如果樣本中白細(xì)胞數(shù)量少時(shí),需要制備更多血涂片(如6張)。 

3.2.1.2 使用EDTA-K2抗凝血液樣本時(shí),應(yīng)在采集后4小時(shí)內(nèi)制備血涂片。在制片前,樣本應(yīng)充分混勻。注意,樣本不能冷藏。 

3.2.1.3 用楔形技術(shù)制備血涂片。在玻片近一端1/3處,加一滴(約0.05ml)充分混勻的血液,握住另一張較狹窄的、邊緣光滑的推片,以30 ~45 角使血滴沿推片迅速散開,快速、平穩(wěn)地推動(dòng)推片至玻片的另一端(見圖1)。 

3.2.1.4  在1小時(shí)內(nèi),用Romanowsky類型染液染色;或在1小時(shí)內(nèi),用無水甲醇(含水量﹤3%)固定后染色。 

3.2.2 良好血涂片的要求 

3.2.2.1 血膜至少長(zhǎng)25mm,至玻片兩側(cè)邊緣的距離至少為5mm。 

3.2.2.2 血膜邊緣要比玻片邊緣窄,且邊緣光滑,適用于油鏡檢查。 

3.2.2.3 血細(xì)胞從厚區(qū)到薄區(qū)逐步均勻分布,末端呈方形或羽毛狀。 

3.2.2.4 血膜末端無粒狀、劃線或裂隙。所有這些情況會(huì)使白細(xì)胞集中在這些區(qū)域內(nèi)。 

3.2.2.5 在鏡檢區(qū)域內(nèi),白細(xì)胞形態(tài)應(yīng)無人為異常改變。通常,隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng),抗凝血會(huì)造成白細(xì)胞形態(tài)的改變,如胞漿內(nèi)形成空泡,核分解破裂等。應(yīng)將抗凝血液保存時(shí)間的影響減小到zui低限度。除部分淋巴細(xì)胞增生性疾病外,鏡檢區(qū)域內(nèi)破損白細(xì)胞量應(yīng) 2%。 

3.2.2.6 無人為污染。 

3.3 血涂片染色 

采用Romanowsky類染料染色。Romanowsky類染料由亞甲藍(lán)和/或亞甲藍(lán)氧化產(chǎn)物(天青B),和鹵化熒光素(通常為伊紅B或Y)組成。良好的染色能準(zhǔn)確鑒別成熟和未成熟白細(xì)胞或異常細(xì)胞。 

3.3.1 染料的性能 

Romanowsky類染料的質(zhì)量直接影響染色效果。在pH6.4~7.0條件下,染料與細(xì)胞中特定成分(細(xì)胞核和細(xì)胞漿特殊顆粒)相互作用,產(chǎn)生典型的顏色,如細(xì)胞核染深紫色,紅細(xì)胞染鮮亮的橙紅色。

3.3.2 可接受的染色qing況 

粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和其他細(xì)胞必須能顯示清晰的核漿分界,能識(shí)別核染色質(zhì)成分和細(xì)胞漿的顏色差異。 

3.4 需分類的外周血有核細(xì)胞 

外周血可見多種有核細(xì)胞。常見的有:中性分葉核粒細(xì)胞、中性桿狀核粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、異型淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。外周血中正常白細(xì)胞的形態(tài)描述見附錄A。 外周血中少見的其他有核細(xì)胞在專業(yè)的血液學(xué)教科書和圖譜中均有描述,本標(biāo)準(zhǔn)中不再敘述。

3.5 血涂片檢查步驟 

3.5.1 血涂片顯微鏡檢查 

3.5.1.1 首先在低倍鏡下(10倍~40倍)進(jìn)行瀏覽,觀察有無異常細(xì)胞和細(xì)胞分布情況。然后,在100倍油鏡下,觀察細(xì)胞漿內(nèi)的顆粒和核分葉情況。 

3.5.1.2 檢查從約50%的紅細(xì)胞互相重疊區(qū)域開始,向紅細(xì)胞完全散開的區(qū)域推移。血涂片較薄的區(qū)域,呈羽毛狀,為 血片邊緣 。 

3.5.1.3 中性粒細(xì)胞,單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分布均勻的區(qū)域?yàn)檠科诸?可接受 區(qū)域。當(dāng)白細(xì)胞總數(shù)正常時(shí),在血涂片尾部和邊緣,每油鏡視野所見的白細(xì)胞數(shù)量不超過血涂片體部的2~3倍。 

3.5.1.4 除某些病理情況(如慢性淋巴細(xì)胞白血?。┩?,破碎細(xì)胞或不能識(shí)別細(xì)胞的數(shù)量不超過白細(xì)胞總數(shù)的2%。若破碎細(xì)胞仍能明確鑒別(如破碎的嗜酸性粒細(xì)胞)應(yīng)包括在分類計(jì)數(shù)中。在結(jié)果報(bào)告中,應(yīng)設(shè)其他欄,以備填寫破碎細(xì)胞或不能識(shí)別細(xì)胞,并作適當(dāng)描述。

3.5.2 計(jì)數(shù)方法 

3.5.2.1 采用 城垛式 方法檢查血涂片(圖1)。每個(gè)明確識(shí)別的細(xì)胞必須歸入下列分類中:中性分葉核粒細(xì)胞;中性桿狀核粒細(xì)胞;淋巴細(xì)胞;異型淋巴細(xì)胞;單核細(xì)胞;嗜酸性粒細(xì)胞;嗜堿性粒細(xì)胞;其他有核細(xì)胞(除有核紅細(xì)胞外)。能明確識(shí)別的破碎細(xì)胞,應(yīng)恰當(dāng)分類。

3.5.2.2 每張血涂片應(yīng)計(jì)數(shù)200個(gè)白細(xì)胞,若樣本中白細(xì)胞數(shù)量減少,應(yīng)增加檢查血涂片的數(shù)量。 

3.5.2.3 白細(xì)胞分類結(jié)果以百分率和值表示。 

3.5.2.4 計(jì)數(shù)所有的有核紅細(xì)胞,結(jié)果以每100個(gè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)中見到幾個(gè)表示。

3.6 檢驗(yàn)人員要求和考核 

3.6.1 檢驗(yàn)人員的要求 

3.6.1.1 檢驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn) 

檢驗(yàn)人員必須能對(duì)所有常見白細(xì)胞進(jìn)行分類,并了解大多數(shù)白細(xì)胞的形態(tài)異常,包括先天性和獲得性。參與細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查的檢驗(yàn)人員必須進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn),并具備實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn)。 

3.6.1.2 檢驗(yàn)人員的態(tài)度 

檢驗(yàn)人員的工作態(tài)度、動(dòng)機(jī)和專心程度是關(guān)鍵因素。因?yàn)榘准?xì)胞分類計(jì)數(shù)是一項(xiàng)主觀性很強(qiáng)的工作,影響分類計(jì)數(shù)的因素很多,有檢驗(yàn)人員的態(tài)度、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件和工作量等。對(duì)于以每張血涂片計(jì)數(shù)200個(gè)白細(xì)胞的參考方法工作量來說,每天每個(gè)檢驗(yàn)人員血涂片檢驗(yàn)數(shù)量約為15~25張。

3.6.2 血涂片考核 

3.6.2.1 考核樣本 

選擇10份樣本。樣本必須包含7種類型白細(xì)胞(中性分葉核粒細(xì)胞、中性桿狀核粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、異型淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)。其中,至少有一份樣本含有少量有核紅細(xì)胞,一份含有少量未成熟白細(xì)胞。 

按照3.2要求,每份樣本制備5張血涂片,按照第3.3節(jié)所述方法染色,統(tǒng)一標(biāo)簽,但檢驗(yàn)人員不知道樣本來源。玻片分成5套,每套包含10份樣本的玻片各1張。 

3.6.2.2 檢驗(yàn)人員考核 

分發(fā)給參加檢驗(yàn)的人員一套考核血涂片,要求每張血涂片做200個(gè)白細(xì)胞的分類計(jì)數(shù),并根據(jù)血涂片編號(hào),報(bào)告結(jié)果,交給監(jiān)考人。監(jiān)考人計(jì)算每份樣本每種細(xì)胞的均值,進(jìn)行結(jié)果解釋,制作每種類型細(xì)胞分布圖。其中橫坐標(biāo)(X軸)為組均值(百分率),組均值為實(shí)驗(yàn)室具備資格的檢驗(yàn)人員計(jì)數(shù)的均值??v坐標(biāo)(Y軸)代表檢驗(yàn)人員個(gè)體的結(jié)果。在圖上添加兩條代表理論上95%和99%可信區(qū)間的線條,由計(jì)數(shù)百分率的標(biāo)準(zhǔn)誤算得,計(jì)算公式見附錄B。

3.6.2.3 解釋 
根據(jù)Gaussian分布假說,5%的個(gè)體結(jié)果可能會(huì)超出95%范圍,但不會(huì)超出99%的限值。 
若數(shù)據(jù)不符合該規(guī)則,表示存在樣本處理過程或操作錯(cuò)誤(如樣本標(biāo)簽錯(cuò)誤,制片不佳,讀片區(qū)域不當(dāng)或細(xì)胞分類錯(cuò)誤)。在分析出可能誤差來源后,必須重新進(jìn)行考核。若不能符合統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)則,應(yīng)高度懷疑結(jié)果的有效性。 

監(jiān)考人必須仔細(xì)地檢查每張圖形。檢驗(yàn)人員數(shù)值應(yīng)該呈隨機(jī)分布。若非如此,評(píng)價(jià)中可能引入了檢驗(yàn)人員的偏倚。應(yīng)該采取糾正措施(如培訓(xùn)或更換人員等),并重新進(jìn)行考核。 
應(yīng)保留一套考核血涂片作為標(biāo)準(zhǔn)片,用于其他檢驗(yàn)人員的培訓(xùn)和考核。

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