摘要：產(chǎn)生抗微生物肽（antimicrobial peptide）是真核生物宿主防御的一個(gè)重要途徑。防御素（defensins）是重要的一類抗微生物肽，包括四個(gè)亞家族，即植物防御素、昆蟲防御素、 -防御素和 -防御素。其中 -防御素主要分布在脊椎動(dòng)物的皮膚、粘膜等上皮組織，構(gòu)成機(jī)體抵御微生物侵襲的*道化學(xué)屏障，在組織燒傷等創(chuàng)傷感染中發(fā)揮重要作用。本文主要對(duì) -防御素的結(jié)構(gòu)、功能、分布和作為抗生素肽的應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。

因感染而造成的燒傷病人死亡率一直居高不下，因此尋找新型的、無細(xì)菌耐藥性的抗生素極其重要。近年研究發(fā)現(xiàn)，真核生物能夠產(chǎn)生大量的抗微生物肽或蛋白，廣泛參與抑制和殺滅外源致病微生物的侵襲，構(gòu)成機(jī)體宿主防御的一個(gè)重要途徑。因其為機(jī)體內(nèi)的天然蛋白，無耐藥性這虞，故有希望開發(fā)為新型的抗生素，解決臨床上因傳統(tǒng)抗生素耐藥而出現(xiàn)的尷尬局面。本文討論的主要是小分子的抗微生物肽（一般小于100個(gè)氨基酸），這些內(nèi)源性的短肽分子能夠破壞微生物細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。人體內(nèi)的防御素可分為 和 兩種。兩者分子結(jié)構(gòu)相似，基因位于同一基因簇中，具有共同的進(jìn)化起源。 -防御素主要由哺乳動(dòng)物中性粒細(xì)胞和小腸Paneth細(xì)胞產(chǎn)生，也見于雌性動(dòng)物的生殖上皮。 -防御素對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、陰性菌、真菌、螺旋菌、分支桿菌、原生動(dòng)物和包膜病毒具有廣譜的殺傷作用。 -防御素由哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞產(chǎn)生，分布在機(jī)體宿主-環(huán)境的界面位置，構(gòu)成機(jī)體抵御外界微生物侵襲的*道化學(xué)屏障。

1、 -防御素的結(jié)構(gòu)

1.1基因定位 目前已恨現(xiàn)的人類 -防御素（humanbeta-defensin,hBD）有3種，即hBD-1，hBD-2和hBD-3。與其他防御素家族成員一樣，其基因均定位于人第第8號(hào)染色體上8P22～8P23區(qū)間＜1Mb的范圍內(nèi)。各種防御素基因在染色體上zui可能的排列順序?yàn)椋褐z粒hBD-2BD1-hNP1-端粒。由于hBD-2基因與其他基因之間的距離比其他基因之間典型的距離要長(zhǎng)很多，所以懷疑hBD-2附近還存在新的防御素基因。Jia等分析了人第8號(hào)染色體8P22～8P23區(qū)間的基因組序列，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的 -防御素成員 hBD-3。該基因位于hBD-2上游13kb的位置，并與hBD-2具有一致的轉(zhuǎn)錄方向。cDNA克隆及編碼氨基酸序列分析表明其與Harder等新近從人牛皮癬病灶皮膚和上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離到的hBD-3相一致。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，在hBD-3上游13kb處還有HE2（human epididymis secretory protein）基因。該基因的mRNA剪接形式之一HEbetal編碼一個(gè)含有同樣的半胱氨酸基元（consensus cysteine motif）的潛在的 -防御素成員。

與hBD-1不同，hBD-2基因上含有多個(gè)核因子 B（NF- B）結(jié)合位點(diǎn)。NF- B是TNF的作用元件，能夠整合損傷或微生物侵襲時(shí)宿主固有的和獲得性的免疫信號(hào)途徑，參與LPS和前炎癥細(xì)胞因子等引起的轉(zhuǎn)錄水平的宿主反應(yīng)。hBD-1基因中缺乏類似的NF- B元件，這或許可以解釋為什么LPS和TNF不能誘導(dǎo)hBD-1表達(dá)。

1.2蛋白結(jié)構(gòu) 人 -防御素hBD-1、hBD-2和hBD-3分別為36個(gè)氨基酸、65個(gè)氨基酸和45個(gè)氨基酸的短肽，其分子中都帶有較多的正電荷，空間結(jié)構(gòu)上分為疏水區(qū)和帶電區(qū)；肽鏈折疊形成三束 -片結(jié)構(gòu)。由6個(gè)半胱氨酸殘基形成三個(gè)二硫鍵穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，分子中均富含精氨酸。其保守的6個(gè)半胱酸形成的三個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵的連接方式為：Cys-2與Cys-4、Cys-1與Cys-5和Cys-3與Cys-6相配對(duì)連接。此外，其分子中還有4個(gè)保守的殘基，即甘氨酸、脯氨酸、蘇氨酸和賴氨酸。

2、生物學(xué)活性

2.1抗微生物活性及其作用機(jī)制  -防御素具有廣譜的抗菌活性。在體外，hBD-1在毫摩爾濃度下對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌、真菌、螺旋體、分析桿菌及有包膜病毒均具有殺滅作用。hBD-2對(duì)革蘭陰性菌有的殺菌作用，在約10 g ml-1的濃度下就可以達(dá)到90%的殺菌效果（LD90）；對(duì)酵母也有有效的殺傷作用，LD90為 g ml-1；而對(duì)革蘭陽(yáng)性hBD-2的濃度要達(dá)到100 g ml-1時(shí)才有抑菌作用。故hBD-2對(duì)革蘭陰性菌的殺傷作用強(qiáng)于對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的作用。hBD-3與hBD-1和hBD-2一樣具有抗菌活性，尤其對(duì)革蘭陽(yáng)性菌具有強(qiáng)裂殺傷作用。微克級(jí)水平的hBD-3對(duì)金黃色葡萄球菌、釀膿鏈球菌等革蘭陽(yáng)性致病菌，革蘭陰性的綠桿菌和大腸桿菌以及酵母都具有強(qiáng)烈的殺傷作用，并且對(duì)多藥抗藥性的金黃色葡萄球菌和抗萬石霉素的糞腸球菌也可在較低濃度下發(fā)揮殺傷作用。

-防御素的直接殺菌作用是由于 -防御素分子呈陽(yáng)性，帶正電荷，能夠與帶負(fù)電荷，呈陰性的細(xì)菌表面結(jié)合，結(jié)合后其分子中的疏水區(qū)可插入到細(xì)菌的胞膜，而其帶電區(qū)（帶正點(diǎn)荷）則與細(xì)菌胞膜上帶負(fù)電荷的磷脂頭部和水分子相互作用。在細(xì)胞膜上多個(gè) -防御素分子聚集形成孔隙或通道，使得正常情況下處于胞外的離子、多肽等流入胞內(nèi)，而胞內(nèi)重要的鹽類、大分子等泄漏到胞外，zui終導(dǎo)致不可逆性的菌體死亡。 -防御素在細(xì)胞膜上的通道形成過程與膜的磷脂組成成分和所處的溫度環(huán)境等因素有關(guān)。然而，一旦 -防御素在膜上行成了通道，上述因素便不會(huì)對(duì)其通道的活動(dòng)構(gòu)成本質(zhì)的影響。另外，由于大多數(shù)真菌、支原體、螺旋體等致病微生物的胞膜也和細(xì)菌一樣帶負(fù)電荷，所以也是 -防御素的攻擊的對(duì)象。 -防御素也可以通過產(chǎn)生單鏈斷裂而誘導(dǎo)DNA損傷。高等動(dòng)物的細(xì)胞則由于細(xì)胞膜中負(fù)電荷含量較低而免于受到攻擊。

對(duì)hBD-2處理過的細(xì)菌菌體進(jìn)行X光衍觀察，其研究結(jié)果支持以上作用機(jī)制。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，hBD-3也可在細(xì)菌胞壁形成孔道，但其確切的機(jī)制是否與hBD-2相同尚不清楚。

內(nèi)源性抗微生物活性肽作為機(jī)體上皮組織抵御環(huán)境中微生物侵襲的*道化學(xué)屏障，其動(dòng)員比特異性抗體或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)更加簡(jiǎn)單而快速。外來信號(hào)誘導(dǎo)其合成不需要細(xì)胞的增殖和分化，在幾小時(shí)內(nèi)人就能起作用，可在感染后短期內(nèi)阻遏、延緩微生物的生長(zhǎng)，或完全消除其感染，因此在機(jī)體的固有免疫（innate immunity）防御中發(fā)揮著重要作用。

2.2免疫活性及作用機(jī)制 與 -防御素一樣， -防御素還具有間接的免疫激活作用。樹突狀細(xì)胞和T細(xì)胞是參與機(jī)體獲得性免疫反應(yīng)的得要細(xì)胞成分。研究表明，在較低的分子濃度下（在體外，zui理想的濃度是1000ng ml-1），hBD-2能夠與這些細(xì)胞表面特異性的趨化因子受體（chemokine c-C motif receptor six）相結(jié)合，趨化這些細(xì)胞朝著受致病微生物侵襲的或粘膜病灶部位遷移，從而提高機(jī)體抗微生物感染的獲得性免疫反應(yīng)水平。其誘導(dǎo)的趨化性對(duì)百日咳毒素敏感，說明 -防御素可能有一個(gè)或多個(gè)具有七次跨膜結(jié)構(gòu)域的受體，或者是受體偶聯(lián)著Gi 蛋白。其誘導(dǎo)趨化作用也能被CCR6抗體阻斷。Becker等對(duì)LPS誘導(dǎo)hBD2表達(dá)，啟動(dòng)機(jī)體固有免疫的信號(hào)途徑進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)LPS需要一種CD14依賴途徑啟動(dòng)人支氣管上皮（hTBE）細(xì)胞合成和分泌hBD2，并zui終激活NF- B。由此可見， -防御素在機(jī)體抗微生物入侵的固有性免疫和獲得性免疫中均具有重要作用。

除此之外，一些防御素還可以封閉促腎上腺皮質(zhì)激素的受體，并且在急性感染時(shí)能夠阻斷具有免疫抑制作用的腎上腺類固醇激素的產(chǎn)生。防御素人為信號(hào)分子的功能也許可以解釋其在濃度很低而不能直接殺死致病微生物產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)。

3、組織分布和表達(dá)調(diào)控

hBD-1zui初是在人的血液濾液中發(fā)現(xiàn)的，隨后的研究表明，hBD-1在腎小管、胰腺、肺、乳腺、腮腺、眼前房、鼻粘膜以及其他一些組織的上皮細(xì)胞中連續(xù)性表達(dá)。zui近的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)人中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和腦膜成纖維細(xì)胞中也有hBD-1表達(dá)，推測(cè)其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)微生物感染的宿主防御中發(fā)揮作用。hBD-2主要在感染刺激后的皮膚和粘膜組織中表達(dá)。Abiko等采用免疫組化和原位雜交的方法研究了hBD-2在人口腔粘膜上皮組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)hBD-2蛋白在過角經(jīng)上皮中的表達(dá)水平顯著高于在正澥化和非角化上皮中的表達(dá)；而mRNA水平卻是在非角化上皮中的表達(dá)高于弱角化或正角化上皮。除正常組織外，hBD-2在腫瘤組織如口腔鱗狀細(xì)胞癌，腫瘤細(xì)胞系如MKN45胃粘膜細(xì)胞和口腔鱗狀細(xì)胞癌Ca-9、SCC-9、HSC-4等細(xì)胞中也有表達(dá)。hBD-3主要由上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生。正常情況下在皮膚和扁桃體中分布zui多，而在呼吸道、消化道和泌尿生殖道分布較少。

-防御素的表達(dá)水平除了受炎性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)外，還受作用環(huán)境的鹽濃度和離子種類的影響。通常情況下，以10mmol L-1的磷酸鹽緩沖液為zui佳；過高的鹽濃度（如100mmol L-1以上PBS）會(huì)導(dǎo)致防御素活性水平急劇下降。另外，一價(jià)離子對(duì)防御素活性影響較小，二價(jià)離子（如鈣、鎂離子）則可顯著降低防御素的活性。的研究還發(fā)現(xiàn)，激素（地塞米松）能夠抑制hBD-3的表達(dá)，但不影響hBD-1和hBD-2的表達(dá)。這一結(jié)果或許可以部分地對(duì)大量使用激素容易引起感染提供解釋。

4、應(yīng)用前景

4.1代抗生素解決細(xì)菌耐藥問題 細(xì)菌對(duì)傳統(tǒng)抗生素的耐藥性是當(dāng)今臨床醫(yī)學(xué)中的全球性難題，發(fā)展新的抗感染戰(zhàn)略勢(shì)在必行。基于 -防御素的殺菌作用，可將其作為 超級(jí) 抗生素，發(fā)揮其廣譜、強(qiáng)效的抗多種微生物感染的作用。同時(shí)，在應(yīng)用上，不同的 -防御素應(yīng)各取所長(zhǎng)，協(xié)同使用，如hBD-2主要針對(duì)革蘭陰性菌，而hBD-3則主要針對(duì)革蘭陽(yáng)性菌。

由于 -防御素蛋白分子較小，且分子中含有3對(duì)二硫鍵，給基因工程表達(dá)帶來了一定困難。不過，令人驚喜的是對(duì)hBD-3的表達(dá)卻獲得了意外的成功，融合表達(dá)的hBD-3從融合形式中酶解下來后再經(jīng)過進(jìn)一步的純化，其生物學(xué)活性可達(dá)到與從組織中分離純化到的天然蛋白一致的水平。此外，小分子的 -防御素也可通過人工合成的方法而獲得。

4.2結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)賦予細(xì)胞自身抗感染能力 組織工程技術(shù)已成為近年組織和器官移植解決供體問題的重要手段，轉(zhuǎn)基因等細(xì)胞修飾和改造技術(shù)則賦予組織工程組織和器官以全新的特質(zhì)。采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得高表達(dá) -防御素基因的人表皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞將對(duì)提高組織工程皮膚的抗感染能力做出貢獻(xiàn)。

報(bào)道表明，hBD-2轉(zhuǎn)染的人巨噬細(xì)胞獲得了對(duì)結(jié)核分支桿菌的殺傷能力，成為 -防御素轉(zhuǎn)基因治療zui早的嘗試。

4.3用于調(diào)動(dòng)機(jī)體獲得性免疫 樹突狀細(xì)胞和記憶T細(xì)胞在機(jī)體的獲得性免疫中具重要作用。要體內(nèi)， -防御素可通過與CCR6的相互作用來募集未成熟的樹突狀細(xì)胞和記憶T細(xì)胞到達(dá)有微生物入侵的皮膚和粘膜部位。因此，我們可以利用 -防御素在固有免疫和獲得性免疫中的雙重作用來輔助傳統(tǒng)抗生素預(yù)防和治療微生物感染。

4.4指導(dǎo)抗微生物短肽類藥物的設(shè)計(jì)和開發(fā)  -防御素由于分子小并具有穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，為當(dāng)今研制多肽類新藥提供了理想的分子設(shè)計(jì)骨架和模板。

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