單抗技術是主要由抗原制備，免疫動物，細胞融合，篩選雜交瘤細胞，克隆化培養(yǎng)，單克隆抗體的大量制備與鑒定等一系列實驗組成的實驗系統(tǒng)，其核心部分是細胞融合。細胞融合是單克隆抗體技術的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是將脾細胞和骨髓瘤細胞混合后加入PEG使細胞彼此融合。

實驗原理:B淋巴細胞能夠產(chǎn)生抗體，但在體外不能進行無限分裂；而骨髓瘤細胞可以在體外無限傳代，但不能產(chǎn)生抗體。將這兩種細胞融合后，用一特殊選擇培養(yǎng)基（HAT）阻斷正常細胞或自體融合細胞的DNA合成通路，而雜交瘤細胞可利用補救通路合成DNA得以生存，且既能產(chǎn)生抗體，又能無限增殖，并以此生產(chǎn)抗體的技術。

實驗方法

材料：Balb/c小鼠，SP2/0骨髓瘤細胞，50%PEG，不完全培養(yǎng)液，HAT培養(yǎng)液，75%酒精，剪刀，鑷子，紗布，離心管，網(wǎng)篩，大小瓶 皿，直頭滴管，彎頭滴管，瓶塞，培養(yǎng)瓶蓋，離心管蓋，燒杯（加入37℃水），泡沫板，大頭針，96孔培養(yǎng)板，計時器，顯微鏡，計數(shù)板等。

單克隆抗體技術方法：

顯微鏡下觀察血片或骨髓片，找出異常細胞。

（1）飼養(yǎng)細胞的制備

1.常用Balb/c小鼠，拉頸處死，浸泡于75%酒精內(nèi)，3～5min。

2.用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜，剪一小口，用滴管注入5～6ml不完全培養(yǎng)液（嚴禁刺破腸管）。

3.反復沖洗，將沖洗液吸入15ml離心管，1000rpm5min離心，用完全培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細胞密度。

（2）SP2/0骨髓瘤細胞的制備

1.選取狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的SP2/0骨髓瘤細胞。

2.棄去原瓶中培養(yǎng)上清，用不完全培養(yǎng)液沖洗三遍。

3.再以不完全培養(yǎng)液對細胞進行充分吹打，得到的細胞懸液移入15ml離心管。

4.細胞計數(shù)。

（3）脾細胞的制備

1.3天前加強免疫的小鼠，摘眼球取血后，拉頸處死，75％酒精浸泡3～5min。

2.將小鼠固定于泡沫板上，打開腹腔，取出脾臟，用不完全培養(yǎng)液反復沖洗。

3.在平皿中的網(wǎng)篩中，用鑷子夾取脾臟進行反復研磨，邊磨邊滴加不完全培養(yǎng)液，直到脾細胞單個化，將細胞懸液轉(zhuǎn)入15ml離心管中。

4.細胞計數(shù)。根據(jù)兩種細胞計數(shù)結(jié)果，調(diào)整懸液用量，配平之后（SP2/0細胞與脾細胞數(shù)量比值在1：5～1：10之間），以1000rpm5min離心。

5.棄上清，每管加入5ml不完全培養(yǎng)液，吹打混勻后合并于同一15ml離心管中，再次以1000rpm5min。

6.離心，棄上清，用滴管吸凈殘留液體。

（4）細胞融合

1.前面步驟所得到的細胞沉淀，輕彈離心管管底，使其呈糊狀。

2.在37℃水浴中，輕輕振蕩，一邊緩緩加入1mlPEG，邊加邊搖，PEG于1min內(nèi)加完。

3.加完PEG之后，將懸液在37℃水浴中靜置1min。

4.繼續(xù)在37℃水浴中，邊搖邊加入不完全培養(yǎng)液2ml，于2min內(nèi)加完。

5.慢慢加入不完全培養(yǎng)液，800rpm，8min。

6.棄上清，加入含1％HAT、20％FCS的培養(yǎng)液，輕輕混勻。

（5）在96孔細胞培養(yǎng)板中加入飼養(yǎng)細胞上清，1滴/孔；之后加入融合細胞懸液，1滴/孔。

（6）鏡下觀察96孔板中細胞情況，CO2孵箱中培養(yǎng)。

單克隆抗體技術實驗結(jié)果計算:一只小鼠可獲得（1～2.5） 108個脾細胞，與（2～3） 107個SP2/0骨髓瘤細胞進行細胞融合。顯微鏡下可見單個分散的細胞，細胞培養(yǎng)3～5天后即可出現(xiàn)小克隆，雜交瘤細胞較大，呈圓形且透明，其它細胞透光性差并逐漸死亡。

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