不讓您寶貴的克隆留下 疤痕 ！

提起傳統(tǒng)酶切連接克隆或載體構(gòu)建，什么讓大家苦不堪言？  

小A：每次都要糾結(jié)于各種限制性內(nèi)切酶的選擇。                    

小B：操作步驟繁瑣，耗時長，至少需三四天才能完成。

小C：每次只能克隆1個目的片段。

小D：片段結(jié)合位置上有時會留下 疤痕 。

忘記苦難，今天小編給大家介紹一種新的克隆方法 一步法同源重組技術(shù)，帶你們脫離苦惱！

一步法同源重組是一種利用同源重組的原理，進行無縫克隆的技術(shù)。該技術(shù)無需考慮酶切位點，幾乎適用于任何載體與任何片段的定向克隆。操作過程簡單快速，只需50℃，20min即可完成反應(yīng)。勁爆的是，多個片段也可以同時克隆哦！

激動寶寶小C：如此厲害，是如何做到呢？

【秘】一步法同源重組的關(guān)鍵在于重組酶。它由三種酶混合而成。分別是外切酶，DNA聚合酶和連接酶。

外切酶活性：該酶能沿著5 3 方向，降解雙鏈DNA，從而產(chǎn)生黏性末端，這樣便于與另外的同源末端進行配對結(jié)合（兩個同源序列通過外切酶的切割，能產(chǎn)生幾乎一致的黏性末端）。

DNA聚合酶活性：外切酶作用后，并不能保證將每一個片段的5 末端都降解成一樣長的黏性末端，同源末端退火配對后，極可能存在缺失的堿基。此時需要借助DNA聚合酶進行修復(fù)缺口。

連接酶活性：催化形成磷酸二酯鍵，將所有缺口補齊，實現(xiàn)無 疤痕 拼接，即無縫克隆。

好奇寶寶小D：外切酶降解雙鏈DNA多長呢？是否會把雙鏈DNA切割成單鏈導(dǎo)致無法進行片段重組呢？

莫擔(dān)心，自有妙招！的重組反應(yīng)溫度是50℃，遠高于外切酶的zui適溫度（37℃），此外，外切酶的含量較低，故重組反應(yīng)體系中很快會失去外切酶活性。對于200bp以上的雙鏈DNA-片段都是完全不用擔(dān)心的，當(dāng)然，幾十bp的小片段是不適合同源重組的。

心急寶寶小B：這么牛掰的，快給我們講講怎么操作吧。

步驟1：制備載體

需將線性化載體的制備好，既可以選擇酶切，也可以選擇PCR的方式制備線性化載體。

步驟2：設(shè)計目的片段引物

在目的片段上下游引物的5 端引入15-25bp左右載體末端同源序列。

步驟3：擴增目的片段

通過PCR的方法，使目的片段的兩端加上了與載體末端相應(yīng)的同源序列。

步驟4：重組反應(yīng)

按比例混合線性化載體和目的片段，50℃反應(yīng)20 min。

步驟5：轉(zhuǎn)化，鑒定

將重組產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化后涂平板，挑取克隆進行陽性鑒定。

機智寶寶小A：有啥應(yīng)用呢？

可以應(yīng)用于定點突變，CRISPR，構(gòu)建多順反子表達載體等等。

 看完有收獲，記得點完贊再走！

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